[发明专利]一种先导编辑系统及基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种先导编辑系统及基因编辑方法。所述先导编辑系统包括具有核酸酶活性的先导编辑器、包含同源序列模板的pegRNA，还包括具有非同源末端修复抑制性的蛋白。本发明在核酸酶先导编辑器的基础上引入一种非同源末端修复抑制性蛋白，显著降低了非精准编辑提高编辑产物的纯度；同时，我们也对修复依赖的同源序列长度进行优化，通过效率比较找到了最佳的长度，即20bp的同源序列长度；这两种优化方式结合进一步提高了精准编辑效率。基于同源依赖性的修复方式，uPEn能够实现高效的小片段插入、删除和替换编辑，并且在传统先导编辑器难以编辑的位点也能实现高效编辑，这将有利于进一步扩大先导编辑工具的实用性。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种先导编辑系统及基因编辑方法。

背景技术

目前，基于CRISPR-Cas系统衍生的一系列基因编辑工具为实现基因组的精准编辑带来巨大的希望。最近出现的先导编辑系统(Prime Editing，PE)代表了一项非常先进的基因编辑技术的突破，它可以在基因组中引入各种类型的碱基突变以及小片段的插入、删除和替换，同时避免造成DNA的双链断裂(Double Stand Break，DSB)。

先导编辑系统由一个Cas9切口酶与逆转录酶融合表达的PE蛋白和一个具有模版及先导作用的prime editing guide RNA(pegRNA)组成，其中pegRNA由3个部分组成，包括single-guide RNA(sgRNA)、引物结合位点(Prime Binding Site，PBS)和带有编辑信息的反转录模板(Reverse Transcription template，RT模板)。最初的第一代PE1和第二代PE2在靶位点的编辑效率有限，最后，研究人员构建了PE3/PE3b，通过共表达靶向互补DNA单链并造成切口(nick)的nick-sgRNA，利用细胞内源性修复机制提高以逆转录链为模版修复的比例，从而进一步提高了编辑的效率。

相比于之前的基因编辑系统，先导编辑功能更强，安全性更高，已被广泛应用于水稻、小麦、斑马鱼和小鼠胚胎等多物种的基因组编辑中。但值得注意的是，先导编辑系统仍然存在的一个重要问题就是编辑效率有限。尤其是对几十bp长度的序列做插入、删除和替换编辑时，编辑效率很低，并且由于常用的PE3系统需要两条gRNA共同发挥作用才能实现有效的编辑，进一步限制了其应用。

最近，一系列针对PE系统优化的工作在一定程度上提高了编辑效率，例如，Anzalone等人(Programmable deletion，replacement，integration and inversion oflarge DNA sequences with twin prime editing Nature Biotechnology，doi.org/10.1038/s41587-021-01133-w)用双pegRNA的策略，提高小片段编辑的效率，但是很大程度上增加了PE系统设计的难度和系统本身的复杂度，增加了其应用的难度。另一项研究报告，Adikusuma等人(Optimized nickase-and nuclease-based prime editing in human andmouse cells.Nucleic Acids Research，doi.org/10.1093/nar/gkab792)利用核酸酶活性的Cas9构建先导编辑系统摆脱了对nick-sgRNA的依赖，但造成了大量的非精准编辑，并且精准编辑效率低。

尽管如此，对于PE的编辑效率在大多数测试的基因组位点仍然是次优的，小片段的编辑仍是PE编辑的一大难点。另外，PE系统对于两条gRNA的依赖也没有得到改善。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种先导编辑系统的开发和应用。

一种先导编辑系统，包括具有核酸酶活性的先导编辑器、包含同源序列模板的pegRNA，还包括具有非同源末端修复抑制性的蛋白。本发明通过引入具有非同源末端修复抑制性的蛋白，通过抑制非同源末端修复，可以显著降低非精准编辑，提高编辑产物的纯度。