[发明专利]一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法

权利要求书

1.一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、缓释碳源材料制备：以丝瓜络为原料，经碱处理、冻融、干燥后获得缓释碳源材料；

S2、反硝化菌株复配：将各厌氧反硝化菌株和各好氧反硝化菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，摇床培养至菌液浑浊，离心收集菌体，用PBS缓冲盐溶液分别配制各反硝化菌株种子液；

将各厌氧反硝化菌株种子液按比例复配，摇床振荡混合，获得厌氧反硝化复配菌株种子液；将各好氧反硝化菌株种子液按比例复配，摇床振荡混合，获得好氧反硝化复配菌株种子液；

S3、厌氧反硝化菌剂制备：将厌氧反硝化复配菌株种子液接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，加入无菌缓释碳源材料，放入摇床37℃、180 rpm固定培养后，离心去除上清液，在尼龙网中用无菌生理盐水振荡洗涤沉淀，去除其表面菌体，获得厌氧反硝化菌剂；

S4、厌氧-好氧复合反硝化菌剂制备：将好氧反硝化复配菌株种子液接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，放入摇床28℃、180 rpm培养24 h，将步骤S4所得厌氧反硝化菌剂转入培养液中继续培养，使得好氧反硝化菌株负载于缓释碳源材料外围，离心去除上清液，获得厌氧-好氧复合反硝化菌剂；

S5、厌氧-好氧复合反硝化菌剂驯化：将步骤S5所得厌氧-好氧复合反硝化菌剂转入硝酸盐培养基中，放入摇床30℃、100 rpm驯化培养，使得好氧反硝化菌株和厌氧反硝化菌株分别稳固定殖在载体外围和内部，离心收集沉淀物，真空冻干后得到长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法，其特征在于：步骤S1所述缓释碳源材料的制备方法具体如下：将丝瓜络粉碎后置于氢氧化钠溶液中，常温下浸泡后，反复冻融数次，离心收集沉淀，用水充分洗涤至中性，干燥至恒重，用60目筛去除过细颗粒，所得产物即为缓释碳源材料。

3. 根据权利要求2所述的一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法，其特征在于：所述丝瓜络和氢氧化钠溶液的固液比为1 g:6-8 mL，氢氧化钠溶液浓度为1-3%，常温浸泡时间为10-30 h，冻融温度分别为-80℃和30℃，冻融时间分别为4 h和1 h，冻融循环次数为1-3次。

4. 根据权利要求1所述的一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法，其特征在于：步骤S2所述厌氧反硝化菌为施氏假单胞菌CCTCC HB 20082814、铜绿假单胞菌CCTCC AB 93066和伊氏副球菌CCTCC AB 206665，所述好氧反硝化菌为假单胞菌CICC25068和池生戴尔福特菌CICC 20570，各反硝化菌株种子液浓度均为10⁸ CFU/mL，厌氧反硝化菌株种子液复配体积比为施氏假单胞菌CCTCC HB 20082814:铜绿假单胞菌CCTCC AB93066:伊氏副球菌CCTCC AB 206665=3-5:3-5:5-9，好氧反硝化菌株种子液复配体积比为假单胞菌CICC 25068:池生戴尔福特菌CICC 20570=1-3:3-7，种子液混合条件为温度30℃、转速180 rpm、时间15 min。

5. 根据权利要求1所述的一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法，其特征在于：步骤S3所述牛肉膏蛋白胨培养基装液量为300 mL/500 mL锥形瓶，厌氧反硝化复配菌株种子液接种量为1-5%，缓释碳源材料与牛肉膏蛋白胨培养基的固液比为1 g:10-20mL，固定培养时间为48-96 h，振荡洗涤时间为20-40 s。

6. 根据权利要求1所述的一种构建长效厌氧-好氧复合反硝化脱氮菌剂的方法，其特征在于：步骤S4所述牛肉膏蛋白胨培养基装液量为300 mL/500 mL锥形瓶，好氧反硝化复配菌株种子液接种量为1-5%，继续培养时间为6-18 h。