[发明专利]一种中华鳖精子形态均质化的处理方法

说明书

本发明公开了一种中华鳖精子形态均质化的处理方法，属于动物医学技术领域，本发明创造性地使用冰醋酸‑乙醇‑磷酸盐溶液使中华鳖精子的形态达到均质化状态，使得繁殖季节睾丸排出的不成熟或者形态不均质的精子在1‑30h内达到形态学均质化的状态，主要表现在精子的头部由肥大变为纤细状，可进一步应用于体外授精等细胞学操作，解决中华鳖精子发生时产生的形态学不均质问题。

技术领域

本发明涉及动物医学技术领域，具体而言，涉及一种中华鳖精子形态均质化的处理方法。

背景技术

中华鳖是一种传统的水产养殖越冬动物，这种动物的精子发生表现出典型的季节性差异。长江流域中华鳖的繁殖期从4月开始，睾丸功能正常，生精细胞持续发育；8月和9月达到繁殖高峰期。然而，精子发射发生在10月份之前，每年10月之后，未成熟的精子会被转移到附睾处储存至下一年的繁殖季节。因此，中华鳖附睾体内精子的保存可分为两个阶段：一是冬眠期间的长期保存，约为半年；二是生殖季节的短期保存。附睾上皮细胞也会根据精子在附睾中的储存方式经历季节性变化。通常认为，睾丸中的精子不能受精，其原因也在于：精子虽然产生于睾丸中，但睾丸中大部分精子是不成熟的，这导致睾丸中精子呈现出不均质的现象。更进一步表现为：睾丸排出的精子中，大量精子呈现出头部肥大的不成熟特征；而成熟的精子头部为细长状。

中华鳖精子头部的形成过程主要包括顶体形成、细胞核浓缩以及细胞核拉长变细，中华鳖的精子从产生到成熟一般需要2～3个月，其中在繁殖的季节附睾中容易排出不均质的精子，表现为含有大量的头部膨大的不成熟精子。精子的繁殖期不均质现象不利于中华鳖体外授精等细胞学操作的进行。因此，有必要开发一种促进中华鳖繁殖季节不均质精子形态成熟的技术。

发明内容

本发明所要解决的问题是促进繁殖期中华鳖不均质精子的形态均质化。

为解决上述问题，本发明第一方面提供一种中华鳖精子形态均质化的处理方法，包括以下步骤：

S1、孵育：取不均质精子与冰醋酸-乙醇-磷酸盐溶液混合，所述不均质精子为中华鳖睾丸排出的不均质精子，将混合液在15～25℃下孵育1～30小时；

S2、收集：取步骤S1中孵育完毕的混合液，离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后用杜氏磷酸盐溶液洗涤2～3次，所述洗涤方式为离心机内以25℃、3000～5000rpm离心6～10分钟，收集沉淀后依据实际情况重悬即可得到形态均质化的精子。

冰醋酸-乙醇-磷酸盐溶液与不均质中华鳖精子混合后，可在短时间内促使未成熟的不均质精子的形态不可逆转化为成熟均质精子形态。

进一步地，所述步骤S1中配制冰醋酸-乙醇-磷酸盐溶液时所述冰醋酸、乙醇、磷酸盐溶液的体积比为1：(2～4)：(5～8)，所述冰醋酸为有氧发酵法制备的食品级冰醋酸，乙醇为采用发酵生产的食品级酒精，纯度95％以上。

优选地，配制所述冰醋酸-乙醇-磷酸盐溶液时冰醋酸、乙醇、磷酸盐溶液的体积比为1:3:6。

优选地，所述磷酸盐溶液包含140mM NaCl，5mM KCl，4mM NaHCO₃，1mM MgSO₄，0.5mMKH₂PO₄，0.5mM Na₂HPO₄，6mM D-葡萄糖。

优选地，所述磷酸盐溶液的pH为7.0～7.4。

精子的最适生存环境为pH＝7.0～7.4，磷酸盐溶液具有较强的缓冲能力可维持稳定的pH环境，同时，促进精子形态均质化的冰醋酸和乙醇的浓度不宜过高，否则会导致精子死亡。

优选地，所述冰醋酸-乙醇-磷酸盐溶液与不均质精子的体积比为1:

(50～100)。