[发明专利]威尼斯镰刀菌TB01的整合位点及其应用

说明书

本发明公开了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，包括两个整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处，以及威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用，保证靶基因能够可靠、高效、稳定的表达。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点及其应用。

背景技术

威尼斯镰刀菌是从3000多株真菌中筛选到的可用于发酵生产菌丝蛋白的工业菌株。该菌株发酵产生的菌丝蛋白与单细胞蛋白相比更加味美，具有类似肉质的组织结构，并且能够提供很好的营养平衡，包括脂肪含量低，氨基酸种类齐全，富含微量元素、维生素及利于人胃肠蠕动的可食性粗纤维。因此，具有部分或全部替代动物性和植物性蛋白质食品的潜力。

为了获得性状更加优良的威尼斯镰刀菌菌株以促进其在菌丝蛋白发酵生产上的应用，目前已成功建立该菌株的遗传转化体系和基因编辑体系。基于这些体系，我们可以顺利完成对靶标基因的敲除，但是如何保证靶基因可靠、高效、稳定的表达还有待探索。当前，真菌中实现靶基因表达的主要方式又依赖于真菌自我复制质粒和在基因组上随机整合。然而，利用自我复制质粒表达标靶基因的明显缺点是，其在没有选择压力的情况下很容易在宿主中(包括威尼斯镰刀菌TB01)丢失；而靶标基因在基因组上随机整合往往表现出基因表达水平不一至，同时可能破坏宿主内源重要基因。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，包括两个配套CRISPR/Cas9系统使用的整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。

还提供了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用，便于对威尼斯镰刀菌TB01的基因组进行定点修饰，保证了靶基因能够可靠、高效、稳定的表达。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，包括两个配套CRISPR/Cas9系统使用的整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。

优选的是，GFP表达盒在所述威尼斯镰刀菌TB01上的插入位点为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处。

一种包含威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种向所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点定点插入不同启动子驱动下的GFP表达盒，含有用于GFP表达盒在威尼斯镰刀菌TB01定点插入所需的CRISPR/Cas9表达载体和供体DNA。

一种向所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点插入基因的方法，针对向威尼斯镰刀菌TB01整合位点定向插入靶基因，构建包含CRISPR/Cas9序列和sgRNA序列的表达载体及相应的供体DNA片段，将所述的载体和供体片段转化所述的威尼斯镰刀菌TB01。

一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的鉴定方法，包括以下步骤：

S1、通过原生质体转化法将GFP表达盒导入到威尼斯镰刀菌TB01中，获得GFP表达文库；

S2、从所述GFP表达文库中筛选出中性插入且能够高表达的荧光菌株；