[发明专利]一种体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法

说明书

本发明公开了一种体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：步骤一、将人诱导多能干细胞，加入MEM/F12细胞培养液培养中培养；步骤二、吸弃mTeSR1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液中培养；步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入MEM/F12培养基进行培养；步骤四、转移至细胞分化培养液内培养；步骤五、采用Accutase细胞消化液进行培养。本发明涉及细胞分化培养技术领域，具体提供了一种可有效提高IPS细胞分化速率的体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法。

技术领域

本发明涉及细胞分化培养技术领域，具体为一种体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法。

背景技术

多能干细胞(PSCs)具有独特的自我更新能力和多系分化潜能，包括诱导性多能干细胞(IPSCs)。人类PSCs，特别是来源于疾病患者的IPSCs，在组织再生医学中的有着多种应用，包括疾病模型的建立，新型治疗药物的研发以及细胞替代疗法的开发，具有广阔的临床前景。IPSCs在再生医学中的应用很大程度上依赖于高效的分化技术，即建立快速有效的方法将其诱导分化成特殊种系和功能完整的后代(例如:各种神经元亚型)。

目前基于化合物的IPS分化相对缓慢且稳定性差，因此有必要提供一种能够高效分化IPS细胞生成人神经元的方法。

发明内容

针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种可有效提高IPS细胞分化速率的体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法。

本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导IPS细胞分化生成人神经元的方法，具体包括下列步骤：

步骤一、将融合度为70-80％的人诱导多能干细胞，加入MEM/F12细胞培养液培养中，在30～38℃、4.5～5.5％的CO₂的培养箱中培养1天；

步骤二、吸弃mTeSR1细胞培养液的上清液以除去未贴壁的细胞，加入神经诱导分化培养液，继续在30～38℃、4.5～5.5％的CO₂培养箱中培养4～5天得到P1代的神经干细胞，培养过程中隔天换液；

步骤三、将聚鸟氨酸、雷帕霉素添加至培养皿内，之后加入MEM/F12培养基，在32～38℃、4.5～5.5％的CO₂的培养箱中培养1h，将P1代的神经干细胞接种到培养皿中培养6～7天，得到P2代的神经干细胞，培养过程中每间隔2天更换一次培养基；

步骤四、将P2代的神经干细胞转移至细胞分化培养液内培养10～12天，并加入分散酶将细胞消化并悬浮培养于细胞分化培养液内，得到P3代的神经干细胞；

步骤五、采用Accutase细胞消化液将P3代的神经干细胞消化3～8分钟后贴壁，神经元贴壁培养液中培养12～15天可以得到成熟的神经元。

作为优选地，步骤一的MEM/F12细胞培养液中添加有ROCK抑制剂。

进一步地，所述神经诱导分化培养液包括MEM/F12培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂和1×GlutaMax细胞添加剂。

进一步地，步骤三中P1代的神经干细胞的接种密度为3.0×10⁴～4.2×10⁴个细胞/cm²。

进一步地，所述细胞分化培养液包括DMEM/F12培养基、0.5×N2细胞添加剂、0.5×B27细胞添加剂和1×GlutaMax细胞添加剂。

进一步地，所述神经元贴壁培养液包括MEM/F12培养基、1×N2细胞添加剂、1×B27细胞添加剂、脑源性神经营养因子10ng/ml、神经胶质细胞源性神经营养因子10ng/ml、促红细胞生成素1μM和L-抗坏血酸200μM。