[发明专利]一种家猪精子金属表面玻璃化冻融方法

说明书

冷冻保存的家猪精液具有安全、灵活和能长期静态保种等优势，但传统方法制备的家猪冻精，复苏后的质量远低于牛、羊等其他大型牲畜，妨碍了猪精液冷冻保存技术的广泛应用。本发明建立和优化了金属表面玻璃化冻融方法，通过加快降温和升温速度、并在冷冻和融化配方中添加依布硒，减少精子悬液的冷冻和融化时间使之快速玻璃化，进而减少了精子膜结构的相分离和氧化变性，提高了精液抗冻性能，使冻融后的家猪精子受精性能得到极大的提高，能够满足家猪人工授精使用，具有在产业中推广应用的价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种家猪精子金属表面玻璃化冻融方法。

背景技术

人工授精是目前养猪业中应用最广泛的猪育种技术，考虑到繁殖性能，人工授精主要使用液体储存的精液（包括低温保存的精液）；但这一技术手段存在保存时间较短等问题，因此难以用于大规模的远距离协同和种公猪遗传资源长期保存。相较于液体保存的精液，超低温冷冻保存的精液具有生物安全性、使用的灵活性、保种能力以及国际贸易的优势；因此在理想情况下，冷冻保存的精液是家猪授精的第一选择。

然而相比于其它哺乳动物，家猪精子有头部体积大、膜不饱和脂肪酸含量多的特点，存在冷休克现象，导致其它动物的冻精技术无法改进推广到家猪精子上，因为冷冻复苏后猪精子复苏率和质量远低于牛、羊等其他大型牲畜，这导致了在实际生产中出现受精率极低的问题。总之，目前基于其它哺乳动物的精子冻存技术方案和相应配方，都不能在家猪精子上良好工作，因此基于精子冷冻保存的家猪扩繁技术无法在实际生产中推广应用。

发明内容

本发明所述家猪精子，指学名为Sus scrofa f. domestica的猪科、猪属家畜雄性个体产生的雄配子（Sperm），文本中的精液指家猪射精后产生的由精子和精浆组成的特殊液体。

本发明所述精子超低温保存特指如下技术方案：通过特定步骤、包括应用与这些步骤配套的配方，处理精子或含精子液体，使其能够在液氮等超低温环境下长期保存，复苏后仍有部分精子保持正常受精能力。

本发明所述依布硒（Ebselen），特指CAS登录号为60940-34-3的小分子有机硒类化合物，其结构如图1所示。

本发明所述玻璃化冷冻金属块，所用金属要求其导热率大于200瓦特/米/开尔文，目前实验发现的最佳选择为纯铜；玻璃化冷冻金属块体积应大于实验用到2毫升规格孔总体积的10倍以上。

发明人长期研究家猪精液冷冻复苏过程中的分子机理发现，造成冷冻复苏后家猪精子质量远低于牛、羊等其他大型牲畜的主要原因是，相比其它哺乳动物，家猪精子大量利用不饱和脂肪酸代替胆固醇，以维持细胞膜的低温稳定性，然而不饱和脂肪酸双键易遭受氧化损伤，特别是过氧化损伤产生的醛类还具有进一步诱导脂质氧化损伤的能力，形成了链式反应，并在铁离子和亚铁离子催化下产生羟自由基，进一步加剧了细胞膜脂质变质，从细胞层面看，在冻存复苏中失能的家猪精子经历了铁死亡过程。另外冻存过程中膜不同组分的相分离和冰晶损伤，也是细胞膜变质的重要原因。

但家猪精子中不饱和脂肪酸含量是由其物种特殊的遗传特征决定的，难以通过常规手段改变其脂膜组分。鉴于此，发明人建立和优化了金属表面玻璃化冷冻(MetalSurface Vitrification, MSV)技术和相应的冻存和复苏液配方，通过一系列综合手段加快降温和升温速度，减少家猪精子的冷冻和融化时间，使家猪精子的膜脂质快速玻璃化，减少膜相分离和冰晶损伤；并利用依布硒来稳定膜结构并对抗脂质过氧化，提高精液抗冻性能，使冻融后的精子保持一定活力，便于在生产中使用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术实施方案做进一步详细说明。