[发明专利]一种培育转抗旱基因杨树的方法

说明书

本发明公开了一种培育转抗旱基因杨树的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明以优良杨树品种为植物材料，通过目的基因克隆、载体构建、农杆菌侵染液的制备、杨树叶片遗传转化，获得转基因抗旱杨树。其中，农杆菌侵染液中含有根据树种的营养需求改进的AAM重悬培养基，杨树叶片遗传转化阶段培养基中含有TDZ和Carb，改进的AAM重悬培养基可充分提高菌液活性和转化效率，加速芽的生长并提高出芽率和阳性率，与Carb的专适搭配可有效保证阳性率并抑制农杆菌的过量生长，TDZ加速叶片细胞分化，不经愈伤组织可直接长出芽点，缩短转化周期，实现高效转化，阳性率可高达62.5％，可加速耐旱型杨树的育种进程。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种培育转抗旱基因杨树的方法。

背景技术

杨树(Populus)是我国北方地区分布最广、造林面积最大的用材树种之一，具有速生丰产、适应性强等特点。然而，在干旱、半干旱地区，由于缺乏灌溉条件，水分亏缺和干旱严重限制了杨树人工林生产力，制约了杨树的经济价值和生态效益。因此，培育耐干旱胁迫的林木优良品系，是提高我国造林成活率与人工林生产力的重要途径。常规育种的核心目标主要是木材的速生性和材性，在一定程度上满足不了林木的抗性，无法高效满足林业发展的需要。利用基因工程技术从基因水平上提高育种的目的性和可操作性，为提高林木的抗逆能力、培育抗逆性强的杨树新品种提供重要途径。

近年来，常采用根癌农杆菌介导法对杨树进行遗传转化，加速了培育耐干旱转基因杨树的进展，但此方法仍然存在愈伤组织诱导缓慢、周期长、转化效率低及阳性率低等问题，耐旱性还有待进一步提高。因此，提供一种转化周期短、效率高、快速诱导不定芽的培育转抗旱基因杨树方法，创制优良的转基因耐旱杨树品种，对促进林木分子育种发展及林业生态文明建设具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种不经愈伤组织直接长出芽点的培育转抗旱基因杨树的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种培育转抗旱基因杨树的方法，包括以下步骤：

1)构建杨树耐干旱胁迫基因的植物表达载体；

2)将所构建的杨树耐干旱胁迫基因的植物表达载体转入农杆菌；

3)将含有杨树耐干旱胁迫基因的重组农杆菌用改进的AAM重悬培养基进行重悬，至OD₆₀₀为0.6-0.9时，加入200μmol/L AS制成农杆菌侵染液；改进的AAM重悬培养基的配方为：蔗糖68500mg/L+葡萄糖36000mg/L+KCl 3000mg/L+谷氨酰胺900mg/L+酸水解酪蛋白500mg/L+MgSO₄ 250mg/L+KH₂PO₄ 185mg/L+精氨酸176mg/L+CaCl₂·2H₂O 150mg/L+肌醇100mg/L+FeNaEDTA 36.7mg/L+VB1 10mg/L+MnSO₄·H₂O 7.58mg/L+甘氨酸7.5mg/L+H₃BO₃3mg/L+ZnSO₄·7H₂O 2mg/L+烟酸1mg/L+VB6 1mg/L+KI 0.8mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L+CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L；

4)选择生长状态良好的杨树组培苗，取顶端幼嫩的叶片为植物材料，去除主叶脉和叶尖，在叶脉处进行创伤处理，置于MS分化培养基中预培养24h；将预培养的叶片取出，置于侵染液中侵染，结束后将叶片取出，用滤纸吸干，放回MS分化培养基中，在黑暗条件下倒置3d；