[发明专利]一种抗PCSK9的纳米抗体的VHH链及其应用

说明书

本发明公开一种抗PCSK9的纳米抗体的VHH链及其应用。抗PCSK9的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4，互补决定区CDR包括：CDR1、CDR2和CDR3；具体的氨基酸序列如下：FR1为SEQ ID NO:1，CDR1为SEQ ID NO:2，FR2为SEQ ID NO:3，CDR2为SEQ ID NO:4，FR3为SEQ ID NO:5，CDR3为SEQ ID NO:6，FR4为SEQ ID NO:7。本发明的抗PCSK9的纳米抗体具有以下有益效果：(1)分子小，药物递送。(2)易制造和表达。(3)亲和力高，特异性强。(4)性能稳定，可塑性好。(5)免疫原性低，代谢特征好。

技术领域

本发明涉及纳米抗体技术领域，尤其涉及一种抗PCSK9的纳米抗体的VHH链及其应用。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一。中国CVD患者约为2.9亿。CVD防治工作仍面临严峻挑战，国内外研究者对CVD的产生机制和治疗的研究从未间断。研究表明，编码前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9(Proprotein convertase subtilisinkexin type 9，PCSK9)基因的突变被确定为家族性高胆固醇血症这种常染色体显性遗传病的产生原因。随后，PCSK9成为预防CVD的主要治疗靶点。这一发现后不久，大规模人群研究表明，遗传变异会导致PCSK9活性增加与LDL胆固醇水平升高，而功能缺失突变能降低低密度脂蛋白胆固醇水平和心血管疾病风险。这些发现说明抑制PCSK9是治疗高胆固醇血症的可行方法，能够降低CVD风险。

PCSK9由Seidah等首次在神经细胞凋亡过程中发现。PCSK9属于丝氨酸蛋白转化酶家族，由12个外显子及11个内含子组成，位于1号染色体的短臂上(1p32.3)，长约22kb。PCSK9蛋白分子量为74kDa，包含692个氨基酸。除了信号肽(氨基酸1-30)外，PCSK9是一具有3个结构域的分泌型het-二聚体蛋白，其包括前结构域(31-152)、催化结构域(153-404)、铰链区(405-454)和富含半胱氨酸及组氨酸的C末端结构域(452-692)。主要在肝脏、神经组织、肾脏细胞和小肠上皮细胞中表达，其中在肝脏和空回肠表达最高。

许多临床试验已经表明，PCSK9抑制剂能够稳健且安全地降低LDL胆固醇水平，预防心血管疾病风险和降低死亡率。两款单克隆抗体alirocumab和evolocumab于2015年获得FDA批准，单克隆抗体每年给药两次或更少并降低治疗费用。

纳米抗体

纳米抗体(Nanobodies,Nbs)是由比利时科学家Hamers-Casterman及其团队于1993年在自然杂志中首次报道发现，在骆驼科动物(骆驼，大羊驼，羊驼及其近亲物种)血液中发现有一部分抗体是缺失轻链的“重链抗体”，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两条重链CH2与CH3区(图1)。VHH保留了全部的抗原结合能力，是最小的保留完整抗原结合片段，被称为单域抗体(Single domain antibodies)，VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kDa。

与传统抗体相比，纳米抗体还具有人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、可溶性好、渗透力强、可识别隐藏表位等优势。纳米抗体独特的物理和化学稳定性等为诊断和治疗提供了新的研究工具。在抗体药物研发、医学基础研究以及疾病诊断和治疗方面越来越受关注。

2018年欧盟批准全球首款用于治疗成年获得性血栓性血小板减少性紫癜的纳米抗体药物—Caplacizumab，通过阻断超大vWF多聚体与血小板的相互作用，从而防止凝血的发生。2021年康宁杰瑞制药，思路迪医药和先声药业合作开发的PD-L1抗体恩维达在中国获批上市，是中国第一个获批上市的纳米抗体药物。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容