[发明专利]一种干细胞来源的类原肠胚模型及其构建方法和应用

说明书

一种干细胞来源的类原肠胚模型及其构建方法和应用。所述类原肠胚模型由人多能干细胞在体外构建得到，一定程度模拟了早期胚胎发育的生物学事件与胚胎的关键结构，如原始内胚层发育、双胚盘建立、羊膜腔和羊膜细胞的出现以及原条出现等，且在蛋白水平和转录组水平均得到验证，能够较好的复现围植入期到原肠胚阶段胚胎的关键特征，并且该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物及环境毒物等的筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药等提供安全性测试。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多能干细胞来源的体外模拟人类围植入期类原肠胚模型及其诱导方法和应用。

背景技术

人类的生命从受精开始，精子和卵子结合形成合子。这种独特的全能细胞经历了连续的分裂和细胞分化，在第五天形成囊胚。囊胚主要由两个细胞群构成：内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)。内细胞团在后期发育中形成胚胎本身和胚胎外组织，而滋养外胚层将进一步发育形成胎盘中的主要成分。胚胎植入前，内部细胞团开始分化为外胚层(EPI)和下胚层(HYPO)。植入后，EPI形成羊膜囊，HYPO形成卵黄囊，随后EPI出现原肠运动，建立具有三胚层的原肠胚。由于技术、伦理限制和样本数量有限等原因，我们对人类围植入期胚胎发育的研究较少。了解人类早期胚胎发育的机制对发育生物学以及再生医学都非常重要。现今我们对人类早期胚胎发育的认识大多来源于卡内基胚胎的组织学和解剖结构的研究，这个阶段仍有较多未知的领域需要探索。

目前，人类植入前和围植入期的胚胎发育研究获得了突破性的进展，研究人员已经能够在体外将人类胚胎培养到原肠发育前的胚胎第14天，或将人幼稚多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells,nhPSC)诱导为植入前类胚体，结合单细胞多组学测序和荧光成像技术，为研究人类原肠胚发育开辟了新的途径，极大地拓展了对早期人类原肠胚发育的特征和机制的了解。虽然有研究尝试利用hPSC建立羊膜类器官或重建原始外胚层的早期发育过程，从三维层面去模拟植入后胚胎发育的过程，但该模型缺乏胚胎的关键结构(双层胚盘、卵黄囊)，并且未观察到人原始内胚层的大致发育过程，因此至今还未建立获得理想的围植入期至植入后类原肠胚的研究模型。

发明内容

本研究建立了将人多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells,hPSC)诱导为类原肠胚的模型与方法，所述类原肠胚模型在体外构建得到，一定程度模拟了早期胚胎发育的生物学事件与胚胎的关键结构，如双层胚盘建立、羊膜腔和羊膜细胞的出现以及原条出现等，且在蛋白水平和转录组水平均得到验证，能够较好的复现围植入期到原肠胚阶段胚胎的关键特征，并且该模型可以批量诱导作为早期胚胎药物筛选模型，从而对某些临床孕早期患者的用药提供安全性测试。

在本发明所使用的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞(human inducedPluripotent Stem Cells，hiPSCs)和人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)，所述人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞均为已经建立的，能够通过公开途径购买得到的人诱导多能干细胞和人胚胎干细胞。在某一个特殊的实施例中，所述人诱导多能干细胞购自：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，细胞名称为DYR0100，目录编号为SCSP-1301；所述人胚胎干细胞购自：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/干细胞库，细胞名称为H1，目录编号为SCSP-301。

本发明的第一个目的是提供一种类原肠胚模型的构建方法，具体为将多能干细胞体外诱导为人类类原肠胚的模型，包括以下步骤，

(1)在多能干细胞长至80-90％汇合度时将细胞消化为单细胞，使用PBS(磷酸盐缓冲液)将细胞进行重悬，得到细胞悬液1；优选的，使用胰蛋白酶TrypLE Select将细胞消化为单细胞。

取细胞悬液1加入含有Y-27632的G1ER培养基进一步重悬细胞，得到细胞悬液2；

将细胞悬液2接种到提前使用抗黏附溶液包被的类胚体培养板中，离心；