[发明专利]一种低温海藻糖酶、其编码序列、高产重组菌株及应用

说明书

本发明公开了一种低温海藻糖酶Mptre15A及其编码基因。低温海藻糖酶MpTre15A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；低温海藻糖酶MpTre15A编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明制得的酶蛋白分子量为66.2KDa，最佳pH值为5.0，最佳温度为50℃，可在4℃‑50℃温度范围内水解海藻糖为葡萄糖，以初始浓度5mg/mL的海藻糖为底物37℃反应60min水解率可达99％以上，4℃反应120min水解率可达89％。该重组表达的海藻糖酶可以用于生物发酵，食品，工业及其它一些领域海藻糖含量测定。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种低温海藻糖酶MpTre15A及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖是一种由两个葡萄糖单位以1，1-糖苷键连接而成的稳定的双糖，广泛的存在于各种生物中，包括古细菌、细菌、酵母、真菌、昆虫、甲壳类、无脊椎动物和植物，但在脊椎动物中没有。在这些生物体中，海藻糖不仅作为碳能的来源，而且还作为各种应激条件的保护剂，如干燥、渗透胁迫、氧化和温度变化(Elbeinetal，2003)。此外，海藻糖还诱导自噬(Sarkar，2007)，是许多病原体的必要代谢物，如结核分枝杆菌(MycobacteriumtubercuLosis)引起的结核病。Mizunoe等最近提出了一种细胞保护氧化应激的机制，并提出海藻糖可能用于治疗许多涉及氧化应激和自噬功能障碍的慢性疾病。因此，这种双糖被认为是一种在制药，食品和化妆品行业中有价值成分。(Elbein et，2003；Ohtake andWang，2011)。

海藻糖酶(葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.28)水解海藻糖产生两个葡萄糖分子，广泛存在于真核生物，细菌和古菌中。在碳水化合物活性酶(CAZy，http://www.cazy.org/)数据库中，海藻糖酶被分为糖苷水解酶37，65和15家族(GH37，GH65，GH15)。GH37家族只含有海藻糖酶，而酸性海藻糖酶和一些磷酸化酶属于GH65家族，少数来源于古菌和细菌的海藻糖酶属于GH15家族。GH15糖酶发现较晚，其生化和结构特征没有得到广泛的研究。

据目前报道的文献来看，热源体属(Thermoplasma sp.)来源的海藻糖酶TVN1315和Ta0286其最适作用温度分别为60℃和50℃，在30～70℃下处理60min稳定性不变；两种海藻糖酶在pH约为3.7时具有最佳活性，在狭窄的pH范围内活跃(Sakaguchi，2015)。硫化叶菌(S.acidocaldarius)来源的海藻糖酶SaTreH1和SaTreH2其最适作用温度分别为60℃和70℃，在30～70℃下处理60min稳定性几乎不变(Mitsuhiro，2018)。分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)来源的海藻糖酶最适作用温度为37℃，最适作用pH为7.0(David Carroll，2007)。

目前，酿酒酵母进行的酒精发酵主要是以淀粉质原料为主，在玉米酒精工厂中未发酵残糖中二糖的主要成分通常是海藻糖，如果在发酵前用海藻糖酶将海藻糖水解为葡萄糖，就可以有更多的葡萄糖用于生产更多的乙醇。也有文献报道谷氨酸发酵过程中会产生海藻糖，影响糖酸转化率。在发酵的后期添加海藻糖酶，可以提高糖源的转化效率以及提高最后的谷氨酸产量。此外，在食品工业中，海藻糖被作为一种食品添加剂，但一些地区人群中存在着肠道糖酶缺乏症，不能将糖水解为葡萄糖。高活性海藻糖酶可以开发为治疗海藻糖酶缺乏的酶制剂药物。因此，高活性海藻糖酶在发酵工业和药物酶开发中都具有良好的应用前景。

低温酶具有在低温下的高活性及容易热灭活的优势，在发酵工业中具有独特的应用优势。已有大量低温淀粉酶、低温蛋白酶及低温葡萄糖苷酶等不同类型低温酶的文献记载，但低温下具有高活性的海藻糖酶尚未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的低温海藻糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，低温海藻糖酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。