[发明专利]一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法

说明书

本发明提供一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，包括：(1)收集分生孢子；(2)将分生孢子制成孢子悬浮液，分别在红色、绿色、蓝色和青色的通道下测量分生孢子的自发光荧光强度，以灰度值表示，筛选具有自发荧光强度特性的菌种；(3)以步骤2筛选出的菌种为对象，在激发光Em＝455nm的波长为300‑430nm，发射光Ex＝375nm的波长为400‑700nm内荧光光谱扫描，根据自发荧光峰值的荧光强度判断橡胶树白粉菌，本发明利用橡胶树白粉菌不同荧光通道的显微观察与荧光光谱结合，对橡胶树白粉菌实现快速准确的识别与鉴定，为橡胶树白粉病预测预报与病害防控提供有力支撑。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法。

背景技术

天然橡胶是我国重要的战略物资，是我国热带地区的重要经济作物。橡胶树叶部长期以来受到白粉菌侵染，是导致其叶部病害最严重的病原物之一。橡胶树白粉病是典型的气传病害，强大的侵染能力和广阔的传播范围使得橡胶树白粉菌危害我国各个橡胶树种植园区，影响天然橡胶产量，带来严重的农作物经济损失。不仅如此，该病原同时还具有无法完全离体培养生物学特性，属专性寄生真菌，这使得针对橡胶树白粉菌的纯化与培养均面临着严重阻碍。

长期以来，传统的监测与形态学鉴别主要是依靠孢子捕捉器与分生孢子形态识别，不仅费时费力，还受空间与发病时间限制。并且白粉菌类分生孢子具有极为相似的形态学特征，难以在种水平上实现鉴别。即使采用单基因序列分析和多基因串联进化分析等分子生物学鉴定技术也面临着对单孢子无效和对专性寄生真菌白粉菌难以纯培养和样品量不足等问题。现有传统橡胶树白粉菌研究与防治手段提供的参考有限，难以满足战略需求，亟需开发高通量监测预警技术提供先导防治。

特异性的光学特征和生理生化指标是智能监测的基础。在生物体中，内源性荧光团的类型和数量是有限的。随时间变化的生理生化情况和定位信息可通过内源性荧光团的自发荧光进行关联和跟踪，对生化性质和代谢活动进行空间和时间的映射，对真菌细胞生物学和代谢研究具有重要意义。内源性荧光团与能量代谢、致病机制等均有紧密联系。目前，已在真菌中鉴定的内源荧光团包括黄素、NAD(P)H和黑色素等。但关于利用真菌孢子的自发荧光实现区分与鉴别的研究并不多见，研究程度尚浅，对专性寄生菌白粉菌的分生孢子自发荧光研究尚属空白。橡胶树白粉菌是重要的专性寄生植物病原真菌，其依靠气传侵染橡胶树叶片，每年使天然橡胶大量减产，对其快速准确的鉴别可以为橡胶树灾害防控提供有力的支持。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，利用橡胶树白粉菌不同荧光通道的显微观察与荧光光谱结合，对橡胶树白粉菌实现快速准确的识别与鉴定，弥补现有识别与鉴定橡胶树白粉菌方法与技术上的不足，为橡胶树白粉菌识别提供了新的思路与方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，包括如下步骤：

S1、收集橡胶树的致病真菌和/或白粉菌的分生孢子；

S2、分生孢子的荧光强度测量：将收集的分生孢子制成孢子悬浮液，使用配备DP80CCD和U-HGLGPS光源的荧光显微镜，分别在红色、绿色、蓝色和青色的通道下，曝光时间为100ms，测量分生孢子的自发光荧光强度，以灰度值表示，筛选出具有自发荧光强度特性的菌种；

S3、分生孢子的荧光光谱测定：以步骤2筛选出的菌种为对象，取0.1～0.3g 其固体分生孢子，分别在激发光Em＝455nm的波长为300-430nm，发射光Ex＝ 375nm的波长为400-700nm的范围内进行荧光光谱扫描，根据自发荧光峰值的荧光强度判断橡胶树白粉菌。

进一步说明，步骤S1中，所述分生孢子的收集包括采集和/或培养方法。

进一步说明，步骤S2中，所述孢子悬浮液的浓度为10⁵CFU/mL。