[发明专利]一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；

（2）取6.0 µL、0.3 ~ 3.0 mg/mL的负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；

（3）继续将6 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的神经元特异性烯醇化酶捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；

（4）继续将3.0 μL、0.8 ~ 1.2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（5）滴加6.0 µL、0.0001 ~ 40 ng/mL的一系列不同浓度的神经元特异性烯醇化酶抗原溶液，用pH = 7.38磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（6）最后将6 μL浓度为0.3 ~ 3.0 mg/mL的金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1小时，超纯水清洗，制得一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，于4℃冰箱中储存备用。

2.如权利要求1所述的一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器的制备方法，所述负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备，其特征在于，步骤如下：

（1）混合价二氧化铈的制备

将4 mL 0.2 mol/L硝酸铈溶液加入26 mL 1 mmol/L磷酸钠溶液中，搅拌5分钟，转入聚四氟乙烯高压反应釜中加热到100 ~ 200°C保持12 ~ 20小时，然后用超纯水和乙醇依次洗涤三次，60℃真空干燥箱中烘干12 h，程序升温至400 ~ 600℃煅烧4 ~ 8小时，升温速率控制为5 ~ 10°C/min，制得混合价二氧化铈；

（2）金纳米颗粒溶液的制备

将1 mL 0.01 mol/L氯金酸溶液、1 mL 0.01 mol/L柠檬酸三钠溶液在搅拌下依次加至18 mL超纯水中，搅拌5 ~ 15分钟后，加入1 mL 0.1 mol/L新制备的四氢硼酸钠溶液，在冰水浴中保持10 ~ 30分钟，后在室温下继续搅拌30分钟，静置12 h，制得金纳米颗粒溶液；

（3）负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液的制备

将上述制备的10.5 ~ 105 mg混合价二氧化铈添加到上述制备的21 mL金纳米颗粒溶液中，搅拌1 ~ 5 h，以获得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料溶液，分别用超纯水和乙醇离心洗涤后，60℃真空干燥12 h，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料,取上述制备的0.5 ~ 5 mg负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料加至1 mL超纯水中，超声30 min，制得负载金纳米颗粒的混合价二氧化铈复合材料分散液。

3.如权利要求1所述一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的制备方法，所述金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备，其特征在于，步骤如下：

（1）金银纳米团簇的制备

将4 mL 5 ~ 15 mmol/L氯金酸溶液和1 mL 2 ~ 10 mmol/L硝酸银溶液加入到新鲜制备的5 mL 5 ~ 15 mmol/L谷胱甘肽GSH溶液中，滴加10 μL 1 ~ 5 mol/L的氢氧化钠溶液使沉淀溶解，将混合溶液在70 ~ 95°C温和搅拌下加热4 ~ 24 h，冷却到室温后，透析纯化24h，然后用体积比为1:3的水/乙腈混合溶液洗涤，60℃干燥12 h，制得金银纳米团簇，于4°C冰箱中储存备用；

（2）金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液的制备

将1 ~ 5 mol/L 1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺、0.1 ~ 1 mol/L N-羟基丁二酰亚胺与1 mL上述制备的金银纳米团簇混合，4℃孵育5 ~ 10小时后，在12000 rpm下离心，分离上述溶液，加入100 ~ 500 μL神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液，室温下震荡10 ~40分钟，得到金银纳米团簇标记的神经元特异性烯醇化酶检测抗体溶液。

4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器，用于神经元特异性烯醇化酶的检测，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的基于金银纳米团簇聚集诱导发光的免疫传感器为工作电极，光电倍增管的高压设置为500 V，扫描电位为0 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 7.38的含100 mmol/L三乙胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原溶液进行检测；

（4）利用工作曲线法，求得待测样品中神经元特异性烯醇化酶的浓度。