[发明专利]间歇性灌流联合分批流加培养

说明书

一种通过间歇性灌流联合分批流加培养模式进行的细胞培养方法，包括分批流加培养并在中后期交替进行一期或多期灌流以提高产品产量和质量。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及提高重组蛋白产品产量和质量的细胞培养方法。

背景技术

过去十年，单克隆抗体和融合蛋白等重组蛋白生产领域涌现了众多细胞培养模式。其中，分批流加培养因其操作简便及其可扩展性成为大规模生产最为广泛采用的方法。灌流培养是另一种常用培养策略，这种方式需要连续的培养基置换，对培养基的需求量非常大，通常要进行专门的生产厂房设计来满足大量培养基的配制和存储，而且也需要有细胞截留系统和相应的下游加工能力以实现连续培养基置换和产品收获，但其相比分批流加培养在提高产品产量和质量方面有明显优势。

分批流加培养通常持续14天左右，生长曲线历经4个不同阶段：潜伏期，指数期，稳定期和衰亡期。细胞衰亡期是细胞状态不佳的直接反映，通常因细胞培养过程中有毒代谢物的积累所致。蛋白酶、还原酶、糖基化酶和唾液酸酶等大量释放进入细胞培养物所形成的环境条件会进一步加剧细胞衰亡，可能导致蛋白质降解和蛋白质糖型结构改变。最后，细胞衰亡还会导致产率降低和培养过程提前终止。在分批流加培养模式中，批量添加营养物质可在一定程度上缓解或延缓细胞衰亡，但不能从根本上解决全部问题和难题。

目前常用培养基优化来提高细胞活率和产品产量。通过调整补料策略或补充添加剂，可以更好地维持细胞活率和细胞状态。但是，培养基优化策略未必对所有细胞系都普遍有效或适合。过程参数优化例如降温策略是另一种可有效提高细胞表现的方法。但是，同样地，这些调节并非普遍可行。维持细胞活率的另一种方法是采用基因工程方法来抑制细胞衰亡，包括例如过表达凋亡负调节因子(BCL-2、BCL-xL和MCL-1)、敲除凋亡正调节因子(BAK和BAX)、以及过表达HSP27、HSP70或两者来减弱细胞凋亡(Matthew N.Henry等，Biotechnology and Bioengineering.2020；117:1187–1203)。然而，细胞系的基因工程改造通常需要复杂的设计、执行和验证过程。总之，上述方法都不能完全解决有害副产物积累这一问题，而该问题是细胞培养中后期细胞表现不佳的潜在的根本原因。

灌流工艺的普及很大程度上得益于其通过连续去除废旧培养基和补充新鲜培养基来延长细胞培养周期的能力。然而，目前的方法需要昂贵的投入来建造各种必需的设施，培养基制备工作繁重，产品生产成本高昂。大量废旧培养基的处理也是困扰和难题。因此，全灌流培养未必适合所有重组蛋白的生产。

因此，需要更好的细胞培养方法尤其是哺乳动物细胞培养方法，从而能更广泛地用于更多重组蛋白的生产来更有效地提高产品的产量和质量。

发明内容

总体而言，本文提供了一种基于本发明“间歇性灌流联合分批流加(IntermittentPerfusion Fed Batch，亦简称“IPFB”)”模式的细胞培养新方法，用以提高重组蛋白生产的产量、质量和上游经济效益。大体上，这种新的培养模式是在传统分批流加模式的基础上在其中后期引入一期或多期灌流操作。

内容之一，本发明提供了一种细胞培养方法，包括分批流加培养和其间的至少第一期灌流，所述第一期灌流于降温后0-7天或活细胞密度(VCD)升至峰值后0-5天启动。

或者，优选地，有些情形中，本发明方法还包括一期或多期追加灌流，所述追加灌流各自于前一期灌流结束后1至5天启动，例如2天、3天或4天后。

或者，优选地，有些情形中，本发明方法还包括采用灌流培养和/或强化分批流加培养的种子扩增培养向所述分批流加培养提供接种来源。

一些实施方式中，所述细胞是重组表达目标产物的工程化宿主细胞，所述方法包括收获表达产物的步骤。细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO细胞，目标产物可以是多肽，单克隆抗体。因此，本文提供生产目标产物的方法，包括采用本发明的方法培养表达目标产物的细胞并收获表达的目标产物。