[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE及制备方法和应用

权利要求书

1.结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE，其特征在于：由结核分枝杆菌复制和休眠期免疫优势抗原BfrB和休眠期免疫优势抗原GrpE联合构建而成，氨基酸序列为：

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2.结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

一、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE的构建

二、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE小批量表达

三、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE发酵表达

四、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE的工业化发酵

五、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE的纯化。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE的制备方法，其特征在于：所述步骤一具体为：设计BfrB-GrpE融合基因，两个基因之间加linker，翻译成氨基酸序列为：

MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS*

下划线为linker

将pET30a(+)-BfrB-GrpE基因优化并合成，得到pET30a(+)-BfrB-GrpE载体。

4.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE的制备方法，其特征在于：所述步骤二具体为：将构建成功的pET30a(+)-BfrB-GrpE载体转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)-pLySs感受态细胞中用于后期目的蛋白表达；将表达菌株活化后接种37℃震荡培养过夜，取2ml活化后菌体加入200mlLB培养基中37℃震荡培养6h；加入蛋白诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导振荡培养6h；4℃，8000rpm，离心20min收获湿菌；菌体重悬于PB缓冲液10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌3遍；4℃，8000rpm，离心20min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行丙烯酰胺凝胶电泳。