[发明专利]一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法及其应用

说明书

本发明公开了一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，包括如下步骤：S1.挑取活化好的不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子进行培养，获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液；S2.将步骤S1的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃上清，无菌水重悬，离心，弃上清，再用无菌水重悬并调节担孢子液OD₆₀₀至0.8～1.2，获得不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液；S3.将不同交配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液等体积混匀，取混合液滴至PDA固体培养基上，于26～30℃培养6～8天，即获得甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体。本发明培养获得的初生菌丝体可弥补目前甘蔗鞭黑粉菌研究上存在的不足，可用于甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫和生防菌筛选等方面的研究。

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，更具体地，涉及一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法及其应用。

背景技术

甘蔗是重要的经济作物之一，其种植面积占总糖料作物种植面积的90％以上。甘蔗病害尤其是真菌性病害严重影响甘蔗的田间产量，其中以甘蔗鞭黑穗病造成的危害最严重。经鉴定，甘蔗鞭黑穗病病原菌为担子菌亚门黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌(Sporisoriumscitamineum，Ss)。甘蔗鞭黑粉菌的生活史分生活史可分为3个不同的阶段：单倍体酵母样担孢子、双核菌丝和二倍体冬孢子。其中单倍体担孢子不具备侵染甘蔗的能力，而由不同交配型单倍体进行有性配合后形成的双核菌丝体具有致病性，能穿透植物组织进行侵染。侵染菌丝吸取寄主体内的营养物质并随着蔗株生长点向上生长而逐渐向上蔓延，最终在蔗稍抽出黑鞭，黑鞭中充满大量的冬孢子。病菌冬孢子可随气流、雨水等媒介进行远距离传播，亦可落入土壤长期存活。冬孢子在适宜的环境条件下萌发出长短不一的担子，每个担子细胞又可以产生1至数个单倍体担孢子，异型担孢子经有性配合后形成菌丝可再次侵染蔗株完成再侵染。

由于甘蔗鞭黑粉菌担孢子为单倍体，不具有致病性，而其经有性配合后形成具有侵染能力的双核菌丝。因此，有性配合是甘蔗鞭黑粉菌致病性的关键过程之一。近年来，其复杂的有性配合分子调控机制被逐渐解析，为依赖cAMP和MAPK途径的信号通路。具体的：交配型等位基因a位点编码信息素被其相对性别受体蛋白Pra1/2识别，经由受体蛋白将信号传递至胞内。由cAMP和MAPK途径逐级传递至全局调控因子Prf1，进而影响交配型等位基因b位点表达从而完成有性配合。由于甘蔗鞭黑粉菌从侵染甘蔗到发病有着较长的潜伏期且发病前病状不容易被察觉使得甘蔗黑粉病不容易被有效的防治。因此深入研究其致病机理，可以为有效防治甘蔗黑粉病提供理论基础。例如中国专利CN108552205A公开了法尼醇在防治黑粉病中的用途、中国专利CN106942230A公开了法尼醇在防治黑粉病中的用途、中国专利CN105925498A公开了假单胞菌属菌株ST4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用，目前现有技术中针对甘蔗鞭黑粉菌的研究主要是研究其担孢子及二态型转变。由于缺乏甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，使得甘蔗鞭黑粉菌菌丝侵染作为侵染甘蔗的直接途径的相关研究并未展开，导致影响甘蔗鞭黑粉菌丝生长及其致病性的分子机制鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，所述方法可有效分离并培养甘蔗鞭黑粉菌菌丝体。弥补目前甘蔗鞭黑粉菌仅研究担孢子及二态型转变存在的不足，并成功应用于甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫和生防菌筛选等方面的研究。

本发明的第二个目的在于提供分离获得的甘蔗鞭黑粉菌初生菌丝体在甘蔗鞭黑粉菌环境胁迫和生防菌筛选中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种甘蔗鞭黑粉菌菌丝体的培养方法，包括如下步骤：

S1.分别挑取活化好的不同交配型(+、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子进行培养，获得甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液；

S2.将步骤S1获得的甘蔗鞭黑粉菌担孢子母液离心弃上清，无菌水重悬，离心，弃上清，再用无菌水重悬并调节担孢子液OD₆₀₀至0.8～1.2，获得不同交配型(+、-)的甘蔗鞭黑粉菌担孢子液；