[发明专利]GCK基因突变的细胞模型及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、针对GCK基因需要突变的目的基因位点，设计gRNA靶点；

S2、根据gRNA靶点合成插入片段，并构建敲除质粒；

S3、将敲除质粒转染至Hela细胞，得到GCK基因突变的Hela细胞模型；

其中，所述gRNA靶点的序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述gRNA靶点对应的正向引物GCK-g3-FP的序列如SEQ ID No.2所示，所述gRNA靶点对应的反向引物GCK-g3-RP的序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述插入片段具体包括：利用正向引物GCK-g3-FP和反向引物GCK-g3-RP合成的引物合成引物二聚体。

4.根据权利要求3所述的GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述构建敲除质粒具体包括：使用DNA ligase将酶切好的pU6-gRNA-cas9质粒与引物二聚体连接起来，得到敲除质粒。

5.根据权利要求1所述的GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤S3之后还包括步骤S4：转染敲除质粒的Hela细胞的活性检测和单克隆细胞的目的位点基因鉴定。

6.根据权利要求5所述的GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，所述活性检测时，提取转染敲除质粒Hela细胞的基因组，以基因组DNA为模板，采用正向引物GCK-F1和反向引物GCK-R1进行扩增，回收产物后进行活性检测；

所述正向引物GCK-F1的序列如SEQ ID No.4所示；

所述反向引物GCK-R1的序列如SEQ ID No.5所示。

7.根据权利要求6所述的GCK基因突变的Hela细胞模型的构建方法，其特征在于，所述目的位点基因鉴定时，使用所述正向引物GCK-F1和所述反向引物GCK-R1对单克隆细胞基因组DNA进行PCR扩增，回收产物后进行一代测序。

8.一种GCK基因突变的Hela细胞模型，其特征在于，根据权利要求1-7任一项所述的构建方法构建而得。

9.权利要求8所述GCK基因突变的Hela细胞模型的应用，其特征在于，所述GCK基因突变的Hela细胞模型在由GCK突变所致糖尿病的机理研究、药物筛选以及防治产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、药物或保健品。