[发明专利]三维培养间充质干细胞外泌体在制备皮肤损伤修复与再生的药物或制剂中的应用

权利要求书

1.三维培养间充质干细胞外泌体在制备皮肤损伤修复与再生的药物或制剂中的应用，其特征在于，所述外泌体提取自羊的胎盘组织、子宫内膜间充质干细胞，所述间充质干细胞为经过体外三维培养的间充质干细胞，所述皮肤损伤修复与再生为对皮肤的割伤、紫外线损伤、有毒有害气/液体损伤、擦伤、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤的修复与再生；三维培养间充质干细胞来源的外泌体能够发挥免疫调节作用、抑制皮肤炎症，促进皮肤愈合，降低瘢痕产生。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源的外泌体通过如下方法制备获得：

1)间充质干细胞的原代分离：将羊的胎盘、子宫内膜等组织经预处理后，取其间充质区，分离获得间充质干细胞，进行体外二维条件下的扩增培养；

2)间充质干细胞培养扩增到第二代时，将间充质干细胞种植于低粘附板上进行三维培养扩增，间充质干细胞将在三维条件下进行成球培养。

3.间充质干细胞外泌体的提取：将权利要求2步骤2）中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤1）所述预处理是指将羊胎盘羊膜面、底蜕膜面、脐带根部、脐带部等分别剥离、子宫内膜组织等分别进行处理，将组织经无菌的生理盐水清洗后，再用无血清干细胞培养基清洗，然后离心弃上清，得到胎盘不同部位的间充质区。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤1）所述间充质干细胞通过如下方法获得：将预处理后的不同胎盘部位的间充质区切块，置于不含有双抗的无血清间充质干细胞培养基中，加入混合胶原酶消化，得到间充质干细胞后使用筛网进行过滤。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2）所述培养是指将间充质干细胞置于低粘附板上，无血清培养基中，37℃和5% CO₂条件培养24h-48 h。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，权利要求3所述分离提取是指将收集的细胞培养液离心，收取上清液后进行离心处理，获得的上清液过滤后再次离心，弃上清，向沉淀中加入生理盐水混匀得到悬液，将悬液离心后弃上清，加入无菌生理盐水溶液后静置，然后过滤，获得间充质干细胞来源的外泌体。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述混合胶原酶用量为细胞体积的1-5倍，所述胶原酶的浓度为0.075-0.1g/mL。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，权利要求3所述收取上清液后进行离心处理中，离心处理是指将细胞上清液经1 ,500×g离心10min，收取上清；再经10，000×g离心30min；所述悬液离心条件为120,000×g离心60min。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述过滤均为经过0 .22µm滤器进行过滤；所述静置时间为30min。