[发明专利]增强α-突触核蛋白聚集体对细胞膜破坏能力的方法

说明书

本发明公开了增强α‑突触核蛋白(α‑Syn)聚集体对细胞膜破坏能力的方法，将140μL0.01M PBS溶解1mg重组人α‑Syn，然后分别添加70μL PBS、健康人员、PD患者血浆在37℃环境下恒温振荡孵育4天，以酸性磷脂1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑L‑丝氨酸(POPS)为原料，采用薄膜分散‑超声法制备小单室脂质体(SUVs)，将不同浓度的蛋白分别与SUVs及SH‑SY5Y细胞孵育，通过钙黄绿素泄露实验观察不同条件下形成的α‑Syn聚集体对细胞膜的破坏能力。结果表明结果表明PD患者血浆孵育形成的α‑Syn聚集体对细胞膜的破坏能力更强。

【技术领域】

本发明属于α-突触核蛋白聚集体技术领域，涉及增强α-突触核蛋白聚集体对细胞膜破坏能力的方法。

【背景技术】

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以运动障碍为常见临床表现的α-突触核蛋白病，它病理特点是中脑黑质-纹状体多巴胺能神经元的大量进行性丢失，以及残存神经元胞体内存在由α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)异常聚集组成的包涵体-路易小体(Lewy bodies，LBs)。PD的临床表现主要为行为迟缓、静止性震颤等运动症状和精神、认知障碍和感觉障碍等非运动症状。

α-Syn是由140个氨基酸组成的可溶性蛋白质，多以单体形式分布在突触前末梢。在生理条件下，α-Syn主要以无序状态和α-螺旋状态存在；而在病理条件下，α-Syn容易发生聚集，首先形成可溶性低聚物，进而组装成有序的、富含β-折叠的不溶性淀粉样原纤维，进一步聚集形成细胞内包涵体，成为突触核蛋白病的标志性病理结构。研究结果显示，不同突触核蛋白病的标志性病理结构的稳定性存在差异，如与PD的标志性病理结构路易小体(Lewy bodies，LBs)相比，MSA的标志性病理结构胶质胞浆包涵体(Glial cytoplasmicinclusions， GCIs)对蛋白酶K(Proteinase K，PK)具有更强的抵抗力，且GCIs来源的α-Syn可造成小鼠产生更严重的神经病理改变，提示两者的α-Syn可能具有不同的蛋白构象。α-Syn构象状态受pH、温度、离子强度和粘度等影响，可在体内、外可进行自组装并聚集，而形成的聚集体可以“种子”的形式，发生类似朊病毒样的播散。

目前已有α-突触核蛋白的研究，例如中国专利申请号CN201610801424.7原细纤维结合抗体及其治疗和诊断帕金森氏症、路易体痴呆和其他α-共核蛋白病的应用，抗体及其片段具有对人类α-突触核蛋白原细纤维高的亲和力和α-突触核蛋白单体的低的结合，组合物包含这样的抗体或片段，利用这样的抗体或片段来检测α-突触核蛋白原细纤维；预防、推迟具有α-突触核蛋白病理的神经退化性疾病的发作或治疗所述疾病；制备治疗具有α-突触核蛋白病理的神经退化性疾病的药物组合物；诊断或监测具有α-突触核蛋白病理的神经退化性疾病进展，以及减少或抑制α-突触核蛋白聚集。

α-Syn聚集体是PD发病过程中的主要的神经毒性物质，其神经毒性与其对细胞膜通透性损伤及其细胞间转移密切相关，并通过进一步造成溶酶体、高尔基体和线粒体等细胞器膜损伤而导致细胞器功能障碍，最终导致神经元损伤。现有研究结果认为，α-Syn聚集体通过改变脂质膜的通透性，破坏钙稳态，进而诱导神经细胞退变。α-Syn聚集体通过其富含β- 片段的区域插入脂质双分子层干扰细胞膜的正常结构，形成细胞膜孔隙状结构，改变细胞膜的通透性，出现钙内流异常，导致神经细胞损伤。有研究结果显示，α-Syn毒性聚集体的形成与特定的细胞微环境有关，PD患者血浆代谢环境能促进α-Syn聚集体的形成，但其孵育形成的聚集体对细胞膜的破坏作用还未可知。

【发明内容】

针对现有研究中，对于α-Syn毒性聚集体的形成与特定的细胞微环境有关，PD患者血浆代谢环境能促进α-Syn聚集体的形成，但其孵育形成的聚集体对细胞膜的破坏作用还未可知的问题，本发明提供了增强α-突触核蛋白聚集体对细胞膜破坏能力的方法，为后续在人工脂质膜和细胞膜水平比较磷酸盐缓冲液(PBS)、健康人群血浆(HC)、PD患者血浆孵育的α-Syn 聚集体对细胞膜破坏能力的差异提供了基础。