[发明专利]四氢叶酸依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06及其应用

说明书

本发明公开了四氢叶酸（tetrahydrofolate,THF）依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06及其应用，从麦草畏降解富集液中扩增出THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的麦草畏脱甲基酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示。本发明提供的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因dmt06在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的脱甲基酶具有麦草畏脱甲基活性，并且降解活性显著高于已报道的麦草畏脱甲基酶Dmt和Dmt50。

技术领域

本发明涉及麦草畏脱甲基酶基因技术领域，特别是涉及四氢叶酸（THF）依赖型麦草畏脱甲基酶基因 dmt06及其应用。

背景技术

在过去、现在和将来，农药都在农业生产上发挥重大的作用，但是农药的不科学使用导致水体、土壤和大气中农药残留超标，严重危害自然环境和人类健康。我国年农药使用量在30万吨（原药）以上，而农药的利用率只有20-30%，其余残留进入生态环境，导致我国土壤和农产品中农药残留普遍超标。在对于残留农药的处理方法中，生物修复尤其是微生物修复安全有效、成本适中、无二次污染，适合大面积面源污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。抗除草剂转基因是解决除草剂药害的有效途径，而抗除草机的基因一般均来自微生物降解基因。

麦草畏（3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸）是一种广谱高效除草剂，能杀死草甘膦抗性杂草，是良好的抗除草剂转基因靶标除草剂。麦草畏在环境中的降解目前主要为微生物降解，目前已筛选到多种麦草畏的降解菌株。微生物降解麦草畏的起始步骤为脱甲基，生成无除草活性的3,6-二氯水杨酸（3,6-dichlorosalicylate,3,6-DCSA）。目前已报道两种类型的麦草畏脱甲基酶：（1）单加氧酶类麦草畏脱甲基酶DMO（dicambamonooxygenase），克隆自 Stenotrophomonas maltophilia DI-6，为依赖NADH提供还原力的三组份单加氧酶。（2）四氢叶酸依赖型（tetrahydrofolate,THF）脱甲基酶：Yao et al.(2016)和Chen et al.(2019)从 Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20中克隆到两个THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因 dmt和 dmt50。Dmt和Dmt50跟DMO一样具有很高的脱甲基活性；但和DMO相比，Dmt和Dmt50显著的缺点是其活性受到产物5-甲基-四氢叶酸（5-methyl-THF）的严重反馈抑制，这极大地限制了其应用价值。孟山都公司利用细菌来源的麦草畏脱甲基酶基因DMO成功构建了抗麦草畏作物，2018年种植面积近3亿亩。随着麦草畏混剂的开发和抗麦草畏的转基因作物技术研究的不断深入，麦草畏在世界范围内的需求量必将大幅增加。目前，少数西方生物技术巨头主导着转基因技术的产权体系，而我国还缺乏具有自主产权的抗除草剂基因（酶）资源，这严重制约了我国抗除草剂转基因作物新品种培育。因此获得新的高效麦草畏脱甲基酶及其基因资源，在抗麦草畏作物构建及麦草畏污染生物修复方面具有很好的应用价值，对推动我国农业和环境生物技术创新具有积极意义。

获得麦草畏脱甲基酶基因在治理农药残留中主要具有以下作用，（一）采用现代微生物发酵技术和酶纯化技术制成酶制剂实现土壤原位修复。（二）通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，综上所述，开展麦草畏脱甲基酶基因的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一个新型高效的THF依赖型麦草畏脱甲基酶基因 dmt06来解决现有的麦草畏脱甲基酶活性低并且受到产物抑制的问题。