[发明专利]微针注射mRNA编码双特异性抗体药物的试剂、方法和应用

权利要求书

1.一种微针皮内注射mRNA编码双特异性抗体的试剂，其特征在于，所述试剂的制备方法包括如下步骤：

（1）双特异性抗体核酸的合成

所述双特异性抗体核酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列，具体合成方法如下：使用BsaI限制性内切酶对质粒模板进行线性化，在37℃的条件下反应3小时，回收纯化质粒线性化的产物以保留线性化质粒为主，配置mRNA IVT反应的体系，将已经纯化的质粒线性化产物与mRNA IVT反应体系混合，在37℃的条件下反应3小时，反应结束后，加入DNaseI，在37℃的条件下反应20分钟，反应结束后，纯化转录产物以去除多余的酶和IVT反应的原料，对纯化后的转录产物进行酶法加帽，在37℃的条件下反应1小时，反应结束后，用LiCl法对加帽产物进行纯化，最终对纯化产物进行常规的定量检测和纯度检测；

（2）水相溶液和脂质溶液的配制

配置水相溶液及脂质混合溶液，其中4X水相溶液配方为：氨基丁三醇99.20mg，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐377.60mg，冰乙酸13.76mg，三水乙酸钠64.00mg，DEPC水40mL；脂质溶液母液的配方为：SM-102 141.36mg，无水乙醇加入量4mL，胆固醇59.26mg，无水乙醇加入量4mL，DSPC 31.44mg，无水乙醇加入量4mL，DMG-PEG₂₀₀₀ 14.97mg，无水乙醇加入量4mL；

配置方案如下：

a、水相溶液的配制：分别精密称取氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、三水乙酸钠及乙酸并用DEPC水溶解成储液后备用，使用时再通过DEPC水稀释至1X的溶液使用；取双特异性抗体核酸通过1X的水相溶液稀释成0.15mg/mL的水相mRNA溶液，配置3.8mL，用冰乙酸调节水相溶液pH为5.5；

b、脂质溶液的配制：精密称取四种脂质并分别加入无水乙醇溶解，按照1：1：1：1的比例吸取、混合均匀即可配置成最终的脂质混合溶液；

（3）微流控纳米药物制备系统制备微针皮内注射mRNA编码双特异性抗体的试剂：

a、按照水相mRNA溶液：有机相脂质溶液=3：1的比例，12mL/min的流速，5mL的制备体积，初始废液0.3mL，终端废液0.05mL的参数，通过微流控纳米药物制备系统制备试剂；

b、制备得到的试剂立即用1X的水相溶液20倍稀释，通过超滤离心管进行离心浓缩，离心条件为2500g，4℃，10min，弃掉超滤离心管下部溶液，直至超滤管上部体积接近初始制备的试剂体积；此时再补加10倍体积的1X的水相溶液继续超滤离心，以期进一步降低乙醇浓度，最终超滤离心得到的样品即为最终微针皮内注射mRNA编码双特异性抗体的试剂样品，其体积应接近于初始制备的试剂体积，4℃保存备用。