[发明专利]一种优化的血小板外泌体冻干粉在糖尿病足溃疡中的应用及其制备方法

权利要求书

1.一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：

S1：在富血小板血浆中加入凝血酶和葡萄糖酸钙，获得激活系统，所述激活系统经过孵育和三次离心激活处理后，获得上清D；

S2：使用差速超速离心法处理上清D，收集沉淀获得外泌体；

S3：使用缓冲液将所述外泌体分散，获得外泌体分散液；再加入抗冻剂，获得待冻干物，经冻干处理后获得外泌体冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，在S1中，凝血酶和葡萄糖酸钙在激活系统中的含量分别为0.1-1U/mL和2-10mmol/L；富血小板血浆中血小板的含量为(1532±81)×10⁹个/mL。

3.根据权利要求2所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为60-90min，温度为37℃。

4.根据权利要求3所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，所述三次离心激活处理包括以下依次进行的步骤：

S1.1：取激活系统经孵育之后的上清液，获得上清A；

S1.2：在4℃下，对上清A以300-500g的转速离心10-15min，收集上清液，获得上清B；

S1.3：在4℃下，对上清B以1500-2000g的转速离心15-20min，收集上清液，获得上清C；

S1.4：在4℃下，对上清B以3000-3500g的转速离心20-30min，收集上清液，获得上清D。

5.根据权利要求4所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，所述差速超速离心法包括以下依次进行的步骤：

S2.1：在4℃下，对上清D以20000-25000g的转速离心30-40min，收集上清液，获得上清E；

S2.2：在4℃下，对上清E以100000-110000g的转速离心60-70min，收集固相部分，获得沉淀A；

S2.3：使用PBS重悬所述沉淀A，获得混悬液；

S2.4：在4℃下，对混悬液以100000-110000g的转速离心60-70min，收集固相部分，获得外泌体。

6.根据权利要求5所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，在S2.1中，使用孔径为0.22μm的过滤器过滤处理所述上清E，然后再进行S2.2。

7.根据权利要求1所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，所述抗冻剂为甘露醇和海藻糖组成的混合物；外泌体、甘露醇和海藻糖的质量比为48-80:10-30:10-3。

8.根据权利要求7所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法，其特征在于，冻干处理的方法为：将待冻干物置于-80℃下预冻8-12h，再在-40℃下真空冻干20-24h，获得述外泌体冻干粉。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法所制备的外泌体冻干粉。

10.根据权利要求9所述的一种优化的血小板外泌体的制备方法所制备的外泌体冻干粉在制备治疗糖尿病溃疡以及基质重塑的药物中的应用。