[发明专利]基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于天然纳米盘SMALP的His‑tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，属于跨膜蛋白受体固定化工程技术领域。该方法首先水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA，将SMA增溶提取单个膜蛋白形成SMALP；接着制备乙烯砜键合硅胶，然后将乙烯砜键合硅胶与SMALP反应，膜蛋白上的His‑tag标签可特异性地与乙烯砜基发生共价键合反应，得到SMALP‑His‑tag键合型细胞膜固定相；最后将固定相通过湿法装柱得到细胞膜色谱柱。该方法制备的细胞膜色谱柱生物识别活性准确度高、蛋白活性位点朝向统一、与载体结合牢固，弥补了现有细胞膜色谱缺乏对蛋白的结构准确度和种类特异性控制的缺陷，提高了其生物识别的准确度、灵敏度和稳定性。

技术领域

本发明属于跨膜蛋白受体固定化工程技术领域，具体涉及一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用在生物识别研究中具有广泛应用需求，生物识别的应用大多依赖于生物活性分子的固定，蛋白质的生化特性或活性被转移到材料表面，从而允许其与选择性靶标相互作用，如表面等离子共振的蛋白芯片、亲和色谱法的生物大分子固定相等。蛋白的活性、位点取向、偶联稳定性直接影响生物识别的效果，因此，选择合理的蛋白质固定化策略至关重要。

细胞膜色谱是一种将膜蛋白固定于固定相载体上的生物色谱分析技术，广泛应用于药物筛选、复杂体系活性组分识别、配体-受体相互作用研究等。细胞膜色谱技术常用的蛋白固定化策略有非共价吸附、位点非特异性化学键合、生物介导的固定化，然而目前的方法难以最大化兼顾蛋白活性、取向和偶联稳定性三个方面。其中，非共价吸附的蛋白结合可逆，造成蛋白易脱落；位点非特异性化学键合可发生在蛋白任意基团，蛋白取向随机使活性位点被掩蔽；生物介导的固定化使用的融合蛋白标签过大，表达过程中代谢负担高，干扰了目标蛋白活性。此外，目前吸附或键合到硅胶载体上的膜均为细胞膜片段，不可避免包含诸多非目标受体，尚未有一种方法实现种类单一的特异性膜蛋白的键合，这些缺陷的存在限制了细胞膜色谱生物识别的灵敏度和准确性。

近年来，发展出一种利用苯乙烯马来酸(SMA)共聚物的膜蛋白纯化技术，可将单个膜蛋白及其相关脂质从细胞膜上分离，并被SMA包围自发形成脂质颗粒(SMALP)，得到完整的膜蛋白并且保持其天然结构和活性。截至目前，SMA主要应用于蛋白的结构和功能研究，如利用SMALP和冷冻电镜测定膜蛋白高分辨率结构、膜蛋白的质谱分析等，将SMA用于蛋白固定化材料还需克服SMALP固定化的挑战。His-tag是一种0.84KD的蛋白融合标签，其分子量小几乎不影响蛋白质天然结构。因His-tag与金属离子形成的配位键是可逆的，所以常用于重组蛋白的纯化，将His-tag用于蛋白固定化、替代细胞膜色谱固定相中的大融合蛋白标签，以最大化保持蛋白质生物活性，需解决His-tag与固定基质的结合力弱的困难。

因此，基于目前尚无关于天然纳米盘SMALP与His-tag的跨膜蛋白受体固定化技术的报道，为提高细胞膜色谱固定相灵敏度和准确性，特此建立一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱制备方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱及其制备方法和应用，该细胞膜色谱固定相的蛋白结构更接近天然结构，活性高、位点特异性强、寿命更长，制备而成的色谱柱生物识别效能高、准确性强、稳定性好；该制备技术操作简单，易于实现。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种基于天然纳米盘SMALP的His-tag键合型细胞膜色谱柱的制备方法，包括：通过水解苯乙烯马来酸酐共聚物得到SMA，将SMA加入到膜悬液中增溶提取单个膜蛋白形成SMALP，将SMALP与乙烯砜键合硅胶反应，使膜蛋白上的His-tag标签与乙烯砜基共价键合，得到SMALP-His-tag键合型细胞膜固定相，再经湿法装柱，制得基于天然纳米盘SMALP的键合型细胞膜色谱柱。