[发明专利]一种高产质粒、其构建方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种高产质粒、其构建方法及其应用。本发明的高产质粒包括正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。本发明的高产质粒在摇瓶发酵的产量相比原质粒有明显提高，且不影响其用于AAV包装后的病毒滴度水平。本发明的高产质粒对于质粒生产能力的提升和生产成本的降低具有重要的应用价值和意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产质粒、其构建方法及其应用。

背景技术

质粒(plasmid)是广泛存在于生物界的环状双链DNA分子。质粒DNA作为最基本的基因载体工具，在分子生物学、生物化学与细胞生物学等学科中得到广泛的应用。质粒是基因工程和在稳定或瞬时转染的宿主中生产重组蛋白的最通用的工具。通过在质粒中插入目的基因，构建重组质粒，使目的基因在动物模型中表达，可以研究动物的生长发育、疾病发生等情况。从分子与细胞层次上探究这些基因的作用机制就需要构建基因的重组质粒，建立转基因宿主，以进行下一步的功能研究。基因编辑工具CRISPR/Cas9基因编辑技术，是以质粒作为表达载体和基因修复序列的供体，从而实现精准地敲除、插入或替换基因组中特定的DNA序列，基因功能研究与疾病的治疗中发挥重要的作用。同时，质粒DNA也是一种潜在的药物活性成分，特别是在兽用疫苗和基因治疗中。

获得足够量的质粒是质粒应用的重要一步。随着基因治疗等领域市场的扩大，质粒原料的生产能力经受的挑战越发严峻。且质粒产量的高低直接决定了企业投入的生产成本的高低。因此，如何提升质粒的生产产能是一个亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高产质粒、其构建方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种高产质粒，包括正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。

作为本发明所述的高产质粒的优选实施方式，所述正调控元件RNAII基因序列如SEQ ID No.1所示。

作为本发明所述的高产质粒的优选实施方式，所述透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

本发明的高产质粒添加了RNAII正向调控元件与透明颤菌血红蛋白vgb基因序列，在大肠杆菌中的质粒小提产量平均提升了7.89倍，中提产量最高提升了1.79倍；在对vgb密码子优化后与优化前相比质粒中提产量最高提升了2.67倍；vgb密码子未优化和优化前后，在5L体积的发酵罐中，发酵28h时的质粒产量分别较原质粒产量提高了1.69和2.08倍。通过质粒的病毒包装滴度测试的比较，改造后的质粒产量得到较大提升，且不显著影响下游的AAV包装滴度。

第二方面，本发明提供所述的高产质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将所述正调控元件RNAII基因序列插入质粒载体复制起始位点上游；

(2)将所述透明颤菌血红蛋白基因序列插入所述正调控元件RNAII基因序列的上游，即成。

第三方面，本发明提供一种高产宿主菌，包含所述的高产质粒。

作为本发明所述的高产宿主菌的优选实施方式，所述宿主菌为大肠杆菌。

第四方面，本发明提供一种细胞，包含所述的高产质粒。

第五方面，本发明提供一种病毒，包含所述的高产质粒中的所述正调控元件RNAII基因序列和透明颤菌血红蛋白基因序列。

第六方面，本发明将所述的高产质粒、所述的构建方法、所述的高产宿主菌在发酵质粒生产中应用。

第七方面，本发明将所述的高产质粒、所述的构建方法、所述的细胞、所述的病毒在AAV包装中应用。