[发明专利]一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用

说明书

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用，涉及细胞冻存技术领域；所述冻存液以质量浓度为0.9％的氯化钠注射液为缓冲液，包括以下体积百分含量的组分：DMSO5％～12％和注射级右旋糖酐401％～5％。本发明的冻存液是针对于自然杀伤细胞有特异的保护作用的冻存液。利用本发明所述冻存液可进行SNK细胞和NK细胞的长期冻存，经5个月的冻存，细胞活力和表型无改变，因此所述冻存液对于自然杀伤细胞有特异的保护作用；而且所述冻存液不含血清和培养基成份，不会引起溶血和凝血，冻存剂可供血液回输使用，可直接应用于临床。

技术领域

本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用。

背景技术

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使细胞代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，所以可以长期保存，在生产和科学研究中，可以节约人力和物力，更重要的是可以保持细胞的特性不变。利用液氮冻存各种哺乳动物细胞，是当前应用较广的一种方法。细胞冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

冷冻保护剂分为两类：一为渗透入细胞内起保护作用的，如甘油、二甲基亚砜、乙二醇、二乙基酰胺等，在冷冻时，保护剂进入细胞，可防止胞内电解质和其它物质的浓度过分增加而起保护作用；另一类额外非穿透性保护剂，如羟乙基淀粉、白蛋白、甲基纤维素、右旋糖酐40等。细胞内保护剂的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，却也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，因为血清可以降低细胞毒性。但血清并不是完美的成分，因为血清中含有生长因子激素等未知成分，增加了污染几率且成本波动较大，所以不推荐用于细胞库及临床应用。作为细胞冷冻保存的保护剂，可替代胎牛血清的物质有甲基纤维素，右旋糖酐等，血清替代物不仅对细胞有保护性，且化学成分明确，较易向临床推广。

目前，尽管大多数研究和医学领域都存在优化的冷冻保存方案和已发表的配方，但技术问题依然存在。主要是复苏之后质量较差，包括细胞存活率降低，细胞出现凋亡、坏死；表观遗传改变；细胞功能丧失；基因表达和形态的改变；复苏后细胞增殖缓慢等。冷冻时，降温速度是影响细胞存活的重要条件之一。当快速冷冻时，细胞内外均出现结冰，细胞受冰晶的机械损伤而死亡；慢速冷冻时，细胞外出现冰晶并逐渐增大，渗透压改变，导致细胞脱水，脱水可达90％以上，细胞内电解质及其它物质的浓度大大增高，引起蛋白质和膜结构改变而致细胞死亡。

并且，不同的细胞有不同的保护剂，而且要求的浓度也不尽相同。如有穿透性的保护剂甘油，并非对所有的细胞都有穿透性，如对牛红细胞就不能穿透。

截止到目前，FDA批准的已上市的细胞和基因治疗药品一共有18种，其中有11种细胞产品涉及到细胞低温保存。关于脐血干细胞低温储存的冻存制剂配方为10％DMSO+1％Dextran40，关于T细胞低温储存的冻存制剂配方有DMSO，Dextran40，HSA，Plasma-LyteA，Dextrose和0.9％NaCl溶液。

免疫细胞冻存液制剂相关专利中的冻存液制剂配方的缓冲液主要有注射用生理盐水，勃脉力A或复方电解质溶液。其中大部分专利中用到了培养基或血清来保护低温保存的细胞，冻存液中其它的试剂包括DMSO，右旋糖酐40，海藻糖，维生素C，人血白蛋白，丙二醇，香菇多糖，甘油，IL-2，聚乙二醇，白酒草皂苷R，羟乙基淀粉，葡萄糖，拟缺香茶菜酮，非必须氨基酸，乙酰胺，茶多酚，甲基纤维素，谷胱甘肽，丙酮酸钠，gamma聚谷氨酸，珍珠草提取液，多元醇，氯化钙，氯化钾，乳酸钠，纤维蛋白原。并且，专利中有的冻存液制剂成分是在试验阶段使用，尚未用于临床。

目前，尚没有针对自然杀伤细胞的可应用于临床级别的冻存液。临床级别的冻存液制剂配方的每种成份应该是可直接应用于临床患者或根据以前的应用先例，使用剂量控制在一定范围内，如DMSO，在临床应用中剂量应该控制在低于1g/kg/天。