[发明专利]一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法

说明书

本发明涉及甘蔗种植研究技术领域，尤其涉及一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。其主要针对现有技术中根瘤菌在甘蔗中应用的详细研究方案欠缺等问题，提出如下技术方案：步骤一：采样；步骤二：分离细菌；步骤三：鉴定细菌；步骤四：细菌内生性检测；步骤五：研究CZGRD1在不同基因型甘蔗体内的定殖组织模式；步骤六：利用¹⁵N同位素稀释技术检测联合固氮。本发明提出的根瘤菌促进甘蔗苗生长和根瘤菌能与甘蔗联合固氮的研究，为甘蔗的低氮高效种植提供理论依据，并结合实际运用，有利于提高甘蔗的产量等特性，有利于促进甘蔗低氮种植的发展，主要应用于根瘤菌对甘蔗种植的影响技术。

技术领域

本发明涉及甘蔗种植研究技术领域，尤其涉及一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。

背景技术

甘蔗为禾本科植物，为我国南方各地常见有栽培植物。具有清热生津，润燥和中，解毒之功效。根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，与豆科植物共生，通过侵染豆科植物根部形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。根瘤菌与豆科植物的共生是生物固氮体系中作用最强的体系，所固定的氮约占生物固氮总量的65％。在农业生产和固氮生态体系中起着极其重要的作用。

甘蔗的生长发育，大致可分为幼苗期、发糵期、茎节伸长期3个阶段；甘蔗在幼苗期以前，主要依靠甘蔗种贮藏的营养，不用向外吸收养分；甘蔗到了发蘖期，会不断地分蘖发枝，而枝叶生长，正需要氮肥；甘蔗到了茎节伸长期，茎杆会长高长粗，叶片会长得宽厚，底下的根系也会长得粗壮。这时是甘蔗生长发育的关键时期，需要大量的氮元素；纵观甘蔗的生长全期，需要氮肥最多。

根瘤菌具备优异的固氮功效，而甘蔗生长周期中对氮肥的需求量也较高，但是在现有技术中，根瘤菌接种技术在豆科作物种植中应用较为广泛，却鲜有根瘤菌在甘蔗(禾本科植物)中应用的详细研究方案，让非豆科作物通过生物固氮满足作物生长发育的氮素营养需求是生物学研究和农业科技的一个重要目标。鉴于此，我们提出一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中存在的现有技术中根瘤菌在甘蔗中应用的详细研究方案欠缺等的问题，提出一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。

本发明的技术方案：一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法，包括以下研究处理步骤：

步骤一：采样；取野外旱坡地割手密的根，存放在塑封袋中，目的用于分离根瘤菌菌；

步骤二：分离细菌；取步骤一中割手密根冲洗清除附着的泥土，取每株割手密植株的鲜根5g，经由处理后研磨成匀浆，匀浆液稀释处理后铺在无氮的YMA培养基上，经由特定的培养环境长出迗单菌落在YMA培养基上划线培养3次纯化菌株；

步骤三：鉴定细菌；用引物799f/1492r(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增各固氮菌的16SrDNA片段(约735bp),测序鉴定细菌的归属；

步骤四：根瘤菌内生性检测；筛选出的根瘤菌以约每毫升培养基含约1*10⁵活细菌的量与甘蔗组培苗在无植物激素和维生素的1/10MS基本培养液中培养，并对培养后的蔗苗处理后分离蔗苗的根和地上苗，浸入无菌磷酸缓冲盐液中研磨匀浆；匀浆液用磷酸缓冲盐液10倍系列稀释，各取100μl铺在培养基上；待菌落长成，计数根瘤菌在蔗苗内的数量，评估根瘤菌的内生定殖能力；

步骤五：研究根瘤菌CZGRD1在不同基因型甘蔗体内的定殖组织模式；将甘蔗组培苗的整条根切成几段制备观察样本，结合共聚焦显微镜和透射电镜观察扫描；