[发明专利]一种产β-榄香烯的工程菌及应用

说明书

本发明公开一种产β‑榄香烯的工程菌及应用。本发明提供的重组菌，为在宿主大肠杆菌BL21(DE3)star中表达IPP和DMAPP生物合成途径相关酶基因以及法尼基焦磷酸合成酶，莴苣来源的吉马烯A合成酶基因突变体；该重组菌在SBMSN培养基中经过IPTG诱导后可以获得吉马烯A前体，经高温转化后生成β‑榄香烯，时间产率达到目前报道的最高水平，为β‑榄香烯的生物合成方面提供可用的菌株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种产β-榄香烯的工程菌及应用，特别涉及一种莴苣来源的吉马烯A合成酶及其突变株的制备及在β-榄香烯的高效生物合成。

背景技术

β-榄香烯是从传统中药温郁金中分离出的一种倍半萜类成分，因其抗肿瘤活性强、作用范围广、毒副作用轻微及不易产生耐药性等优点而具有广泛的应用前景。目前β-榄香烯的获取主要依靠从温郁金中分离提取，但传统的生产方式分离纯化难度大、得率低且成本高，严重阻碍了β-榄香烯的大规模生产与应用。随着合成生物学的发展，利用微生物构建细胞工厂生物合成天然药物成为研究热点，也为β-榄香烯的生产提供了新的思路。

β-榄香烯是一种倍半萜烯，属于倍半萜类大家族。一般来说，植物来源的倍半萜以异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)作为基本的结构元件。IPP和DMAPP在植物中主要通过甲羟戊酸途径(MVA)和甲基赤藓糖醇4-磷酸途径(MEP)进行合成。1分子IPP和1分子DMAPP在异戊烯转移酶的催化作用下，头尾缩合生成香叶基焦磷酸(GPP)，GPP再与1分子IPP缩合生成—法尼基焦磷酸(FPP)，后者在吉马烯A合成酶的作用下生成吉马烯A，进一步发生Cope重排，生成β-榄香烯。目前，在酵母细胞中可构建了吉马烯A的生物合成途径，可用于β-榄香烯的生产。但由于酵母细胞发酵时间长，最短约72小时，产量达到309.8mg/L，时空产率为4.20mg/L.h。张等人构建的酵母工程菌诱导培养144小时后，产量达到469mg/L，时空产率为3.26mg/L.h。

目前国内外文献报道中的β-榄香烯的生物合成多在酿酒酵母中进行，目前还未见在大肠杆菌中进行β-榄香烯全生物合成的报道，而大肠杆菌由于生长迅速，遗传操作简单，发酵方法简单成熟，用于中药活性成分的生物全合成具有很大的优势。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种重组菌，为体内含有或表达异戊烯基焦磷酸IPP和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP生物合成途径相关酶基因以及法尼基焦磷酸合成酶，莴苣来源的吉马烯A合成酶基因突变体。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶基因的编码基因的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1所示。所述莴苣来源的吉马烯A合成酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体是将莴苣来源的吉马烯A合成酶BL21氨基酸序列中第229位、第243位、第364位、第392位、第410位中至少一个进行定点突变。其中第364位的I突变为K，第410位的T突变为S，第392位的T突变为A，第392位的T突变为V，第229位的A突变为S，第243位的S突变为N；

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体是将莴苣来源的吉马烯A合成酶氨基酸序列中第364位的I突变为K和第410位的T突变为S。

本发明的第二个目的是提供一种重组基因工程菌，其特征在于由莴苣来源的吉马烯A合成酶编码基因构建的重组载体、pBbA5c-MM重组载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)star中得到；

所述莴苣来源的吉马烯A合成酶编码基因构建的重组载体由莴苣来源的吉马烯A合成酶突变体与pET28a载体连接得到。

作为优选，所述莴苣来源的吉马烯A合成酶基因的编码基因的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1所示。所述莴苣来源的吉马烯A合成酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。