[发明专利]一种玉米氮响应基因调控元件分析方法

权利要求书

1.一种玉米氮响应基因调控元件分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对不同时间氮刺激处理的样品进行转录组测序，通过分析转录组数据获取差异表达基因DEGs；

(2)利用步骤(1)中的差异表达基因数据构建基因共表达网络，挖掘共表达模块；

(3)计算步骤(2)中每个模块与氮处理和氮代谢的关系，筛选出与氮处理时间和氮响应marker genes紧密相关的模块；

(4)对步骤(3)中获得模块进行功能注释，找出与氮生物过程紧密相关的基因；分析这些基因启动子区域共有调控元件，此步骤每个模块独立分析，无重叠；

(5)将步骤(4)获得的共有元件进行富集分析和氮相关功能预测，筛选出在自身模块的基因启动子区域具有显著富集且在其他模块基因启动子区域不具有显著富集的元件和与氮代谢途径紧密相关的元件,此步骤中的富集分析和功能预测分析独立进行，将两种方法预测的元件合并，并移除重复；

(6)将步骤(5)获得的元件与已知的数据库进行比对，保留与已知转录因子结合位点具有显著相似性的元件，利用酵母单杂交技术进行验证并挖掘参与调控氮响应相关基因的转录因子，验证正确的调控元件即为本发明所获得的元件。

2.根据权利要求1所述的玉米氮响应基因调控元件分析方法，其特征在于，步骤(1)中将低氮条件下培养2周且表现出缺氮症状的玉米幼苗进行氮刺激处理0分钟，15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时和12小时。分别取不同处理时间的玉米根系进行转录组测序，分别取不同处理时间的玉米根系进行转录组测序，每个时间点设3个生物学重复，利用TopHat软件将测序reads比对至玉米B73_V4基因组，FPKM值被用于表示基因的表达水平，R语言包EdgeR用于计算对照和氮处理样品中的差异表达基因，此处差异表达基因的选择标准为：在至少2个处理时间的p值0.05且|log2|1.5。

3.根据权利要求1所述的玉米氮响应基因调控元件分析方法，其特征在于，步骤(2)中利用共表达网络分析R包Weighted Gene Co-Expression Network Analysis对步骤(1)中的分析获得的差异表达基因构建基因共表达网络，利用无维度类型的拓扑重叠矩阵进行网络构建，Cut-off R²设置为0.8，软阈值β设置为14，最小模块大小为100。利用拓扑重叠测量检测基因模块，并将相似的模块合并，阈值0.2，这些模块以不同的颜色进行命名和分类。

4.根据权利要求1所述的玉米氮响应基因调控元件分析方法，其特征在于，步骤(3)中所述的氮响应marker基因的获得方法为：从公共数据库下载氮响应相关的转录组数据，并独立分析各组数据中的差异表达基因，分析不同来源数据中重叠的差异表达基因，并对其进行功能注释，将在不同来源数据中都具有差异表达且表达模式类似、与氮生物过程紧密相关的基因定义为氮响应的marker gene。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(3)计算步骤(2)中获得的模块与氮响应标记基因marker gene、氮处理时间之间的相关性，根据模块性状相关性和p值对所有模块进行排名，最终筛选出与氮处理时间和marker genes紧密相关的模块。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)利用agriGO http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO和Mapman软件对步骤(3)获得的9个模块中的基因进行注释，每个模块中与氮代谢紧密相关得基因被用于共有调控元件富集分析，该步骤可以减低共有调控元件分析的假阳性，最终在所有模块中共鉴定出差异表达基因；以模块为单位，利用MEME-suit软件中的MEME功能对筛选到的基因进行共有调控元件预测，此步骤每个模块独立分析，无重叠，预测范围为基因转录起始区上游1000bp至下游200bp区域，参数设置如下minw 5-15，maxw 20-50，nmotifs 30–50，最终预测获得共有调控元件，E-value0.05。