[发明专利]一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法

说明书

本发明公开了一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，在提取柑橘叶片的化学成分后送入超高效液相色谱‑电喷雾‑四级杆飞行时间质谱分析，下机数据经过预处理后，利用主成分分析得分图、正交偏最小二乘法判别分析得分图等统计手段区分出健康植株和带病植株的差异。本发明首次将高分辨LCMS技术应用于柑橘黄龙病的非靶向分析，尤其适合黄龙病感染早期无症状阶段的诊断。相比现有技术的优点在于：对叶片代谢物进行无偏向分析，可大幅提高早期黄龙病侵染阶段的植株检出率，对田间采集到的无症状样品，检出率超过80％。

【技术领域】

本发明属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法。

【背景技术】

柑橘是世界上最重要的商品水果之一，我国是柑橘的主产国，柑橘产业在我国农村社会与经济中具有重要的地位和作用。黄龙病是柑橘生产上的一种毁灭性病害，中国的柑橘黄龙病主要由亚洲韧皮部杆菌侵染引起，该病菌可通过木虱传播。染病后植株会出现黄梢、树势衰弱、叶片斑驳黄化、生长缓慢、果实着色不均等现象，并最终死亡。黄龙病目前尚无治疗方法，也无完全耐抗品种，所以需要通过早诊断来尽早确定病树并移除，从而减少田间传染源，提高防控效果。但柑橘黄龙病发病存在6-12个月的潜伏期，且部分发病症状与缺素等症状相似，因此通过肉眼观察症状来确定黄龙病树往往造成误判，且耽误在第一时间移除病树，造成黄龙病的传播扩散，造成巨大经济损失。分子检测技术可克服这一缺陷，目前已有相关的研究，例如中国专利申请号201610965716.4公开了柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒及其应用，设计了柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的双重数字PCR定量检测试剂组合物，该试剂盒包含：柑橘病样DNA提取试剂、数字PCR反应试剂、柑橘黄龙病和柑橘溃疡病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板，应用该发明试剂盒检测柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌具有特异性强、抗杂质干扰更好、简便快速、检测灵敏度比现有的实时荧光定量PCR检测方法高约10倍等优点，可用于柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的早期定性、定量检测以及流行病学调查等。

针对柑橘黄龙病的检测，目前已有核酸杂交和血清学检测的方法，但都非常耗时和繁琐。普通PCR、实时荧光定量PCR也可用于此二种病害的检测，但普通PCR检测灵敏度不足，而实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析；另外，实时荧光定量PCR对反应扩增效率要求很高，且易受柑橘样品DNA纯度和PCR抑制因子等因素的影响，导致对目标序列定量的不准确估计和对低含菌量病样的检测灵敏度不足。此外，基于实时荧光定量PCR的复合多靶标体系的优化非常困难，定量分析通量较低。还有，由于黄龙病菌在柑橘植株内含量低且分布不均，因此锚定柑橘体内黄龙病菌DNA片段的分子检测技术，比如PCR方法等，在用于检测时就会出现假阴性，尤其对于早期感染黄龙病菌但尚未表现症状的柑橘树，经常出现检测结果假阴性。因此在黄龙病早期诊断上，亟需一种更为准确的检测方法。

因此，实时荧光定量PCR已不能完全满足黄龙病高灵敏度定量检测的需求。

【发明内容】

针对现有技术中实时荧光定量PCR已不能完全满足黄龙病高灵敏度定量检测、以及针对黄龙病早期感染阶段检测准确率低的问题，本发明提供了一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，本方法利用液质联用仪结合非靶向代谢组学技术检测植株内叶片代谢物在韧皮部杆菌侵染后的变化情况，根据多元分析判别是否感染黄龙病菌，在无症状阶段检出黄龙病菌，弥补现有黄龙病PCR检测技术的不足，具有准确率高、自动化程度高等优势，能尽早发现黄龙病植株，挽回经济损失。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种基于液质联用非靶向分析技术的柑橘黄龙病检测方法，该方法是将柑橘叶片机械匀浆，然后采用溶剂萃取，萃取后的固液混合物通过离心分离得到上清液，上清液过滤后进入超高效液相色谱-电喷雾-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Esi-Qtof-MS，LC-MS)检测并获得实验数据，所得数据经过峰识别、归一化、保留时间校正等预处理，最后利用PCA等统计手段，通过对比健康样品，诊断是否感染黄龙病。