[发明专利]一种基于平铺回流的PCR检测装置及其应用

说明书

本发明涉及一种基于平铺回流的PCR检测装置及其应用，属于生物检测技术领域。本发明提供了一种PCR检测装置，包括液滴生成模块，液滴生成模块包括PCR微流控芯片、芯片压头以及气动模块，PCR微流控芯片包括主片、离散相储液池、连续相储液池和废液池，主片上设有离散相进液口、离散相流道、连续相进液口、连续相流道、微滴暂存腔、微滴扩增腔和通气口，离散相进液口的一端与离散相储液池相连通，另一端与离散相流道相连通，连续相进液口的一端与连续相储液池连通，另一端与连续相流道相连通，离散相流道和连续相流道的末端交汇形成流道口，微滴暂存腔的一端与流道口相连通，另一端与微滴扩增腔相连通。所述PCR检测装置可实现一体化。

技术领域

本发明涉及一种基于平铺回流的PCR检测装置及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析的分子生物学技术。PCR可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加，结合对扩增后样品的检测技术，其越来越多地被运用到食品安全、考古、刑侦及其他生物科学技术领域。

微滴式数字PCR在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统PCR相比，微滴式数字PCR不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低且更实用，在拷贝数变异研究、复杂来源样品中含量极低核酸分子的检测、NGS数据验证、NGS测序文库的鉴定、miRNA等差异微小的基因表达研究等方面具有极高的应用前景。

目前，微滴式数字PCR主要分为流式检测和芯片式检测两种。其中，采用流式检测可使得样品微滴依次经过检测区域，通过PMT(光电倍增管，Photomultiplier Tube)/mppc(硅光电倍增管，Multi-pixel Photon Counter)/apd(雪崩二极管，AvalanchePhotodiode)直接探测到每个微滴通过的信号，获取的微滴信号直接高效，信噪比高，但是，此方法难以实现全自动检测，并且，现有的基于流式检测的半自动或者全自动微滴式数字PCR仪在实现微滴生成、扩增、检测和废物处理时均需要不同程度上开盖，会导致仪器内和环境中的气溶胶对样品不同程度的污染，样本间的交叉污染，同时，现有的基于流式检测的微滴式数字PCR仪在实现全自动时，会使设备体积庞大，占据空间大。

芯片式检测则可以实现微滴生成、扩增和检测均在同一个微流控芯片中完成，一定程度上实现了原位微滴生成、扩增和检测，在全自动仪器中可有效避免气溶胶污染的可能，并且，芯片式检测使用单层微滴平铺扩增，扩增过程中微滴受热更加均匀，温度均一性更高，但是，此方法一般通过CCD(Charge Coupled Device)相机/CMOS(ComplementaryMetal Oxide Semiconductor)相机对平铺的单层微滴进行图像采集和图像处理，通过图像技术获取微滴信号，不可避免会存在成像边缘效应、平场效应等光学问题，对于光路的要求较高，同时，通过图像获取的微滴图片，一般需要通过图像拼接和图像识别两个步骤完成，以图像识别为例，需要进行二值化、去背景、边缘识别、微滴筛选、强度识别等，从获取微滴图像信号到最终得到微滴信号中间经过的处理环节将近十步，而每一步图像处理都将带来新的误差。

因此，亟需找到可将流式检测和芯片式检测的优势集于一体的微滴式数字PCR仪，以解决现有微滴式数字PCR仪存在的缺陷。

发明内容