[发明专利]一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法

说明书

本发明属于染色质分析技术领域，公开了一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法，将Tn5转座酶和抗体分别连接SpyTag和SpyCatcher，通过SpyTag和SpyCatcher之间的相互作用将转座酶Tn5与抗体进行间接融合；利用SpyTagSpyCatcher系统，将不同的抗体与SpyCatcher进行融合，将不同的功能蛋白与SpyTag进行融合，制得用于染色质分析的多任务工具包。本发明利用SpyTagSpyCatcher系统，将其应用扩大化，可以在不同的实验中利用该系统，将融合蛋白这一原本繁琐且活性不稳定的方式变得更高效更稳定，缩短时间，提高实验效率。

技术领域

本发明属于染色质分析技术领域，尤其涉及一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法。

背景技术

蛋白质与DNA互作是基因转录调控的关键，也是启动基因转录的前提。与DNA互作的蛋白质主要包括组蛋白、转录因子、DNA甲基化酶和染色质重塑蛋白等。为了研究蛋白质－DNA互作，研究人员开发了很多方法，其中染色质免疫沉淀(ChIP)就是研究DNA与转录因子互作的一种重要技术，该技术将蛋白质与DNA复合体利用超声进行打断，再通过IP实验将目的蛋白拉下，从而得到与蛋白质互作的DNA序列并进行建库。这一方法从上世纪九十年代提出至今，先后经历了多次技术革新，逐渐有了现在研究蛋白质与DNA互作的方法——CUTTag(Henicoff)。其原理利用Tn5转座酶具有切割双链核酸这一特性，将Protein G/ATn5进行融合表达，利用Protein G/A定位到抗体，在原位将Tn5激活，直接进行建库，达到用更少细胞量得到更高信噪比这一目的。但是该技术一次只能做一种蛋白，据此本发明实验室一直在开发一次能做多个位点的multi CUTTag，原理即利用纳米抗体(羊驼单域重链抗体)或scFv(单链可变区片段)(之后统称抗体)与Tn5转座酶进行大肠杆菌融合表达和纯化，将抗原(感兴趣的Tag序列，可以被抗体识别)序列转染，在透膜剂的作用下让抗体－Tn5进入细胞内，最后利用抗体识别对应的抗原，将Tn5定位到原位进行酶切，以达到将酶切和建库一步完成的目的，同时可以免去对不同抗体的需求。目前，利用常规方法得到抗体与Tn5的融合蛋白需要将不同抗体序列Tn5进行融合表达，这种策略费时费力，不仅需要构建大量质粒并对单独的一种融合蛋白进行纯化，而且，根据实验室前期的实验结果发现，并不是所有的抗体与Tn5融合后都能够具备保持两个功能单元的活性，不同的融合蛋白其Tn5建库活性存在稳定的差异。

SpyTagSpyCatcher系统源自于化脓性链球菌，该菌体内有一种结构域CnaB2，在生理条件下可以自发形成稳定的赖氨酸－天冬氨酸肽键，且在各种条件下都表现出极高的稳定性(Mark Howarth 2011PNAS)。利用该方法可以得到与融合蛋白相似的效果，并且可以避免这种稳定的建库活性差异同时可以利用这种特性进行染色质研究。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有抗体与功能蛋白的融合表达纯化极其耗时。当你需要十种抗体分别与十种功能蛋白融合表达时，你需要构建并纯化100个质粒，工作量巨大。如果利用该系统则只需要纯化20种蛋白即可，省时省力。

(2)在实验室前期工作中发现，不是所有的抗体与Tn5融合后都具备建库能力，如上图展示不同的抗体与Tn5融合表达后所表现的活性不同，这表明不是所有的蛋白都能用来进行CUTTag实验。

(3)目前几乎没有利用SpyTagSpyCatcher系统进行染色质研究的先例。我们利用该系统可以更经济高效地进行染色质研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于染色质分析的多任务工具包及其制备方法。

本发明是这样实现的，一种用于染色质分析的多任务工具包的制备方法，所述用于染色质分析的多任务工具包的制备方法包括：