[发明专利]一种检测IL-33的诊断试剂盒及制备和检测方法

权利要求书

1.一种检测IL-33的诊断试剂盒的制备方法，其特征在于该制备方法包括下述步骤:

1)制备预处理包被反应板：

使用白色聚苯乙烯制备板架，预留与酶标板相互配合的通孔；酶标板与板架配合组装，获得预处理包被反应板，备用；

2)包被板的获得：

用反应缓冲液将抗IL-33单抗稀释至1-4μg/mL，以100μL/孔包被过夜，然后洗涤、封闭、干燥，将微孔板真空密封于铝箔袋内，冷藏备用；

3)制备镧系元素离子标记的抗IL-33单抗：

取IL-33抗体1mg，经PD-10转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，获得浓缩至2g/L的IL-33抗体溶液；取所述IL-33抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃下振荡反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sephadex G-50柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2～8℃保存；

4)制备IL-33校准品溶液：取高浓度的IL-33抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN₃的50mmol/L的pH为7.8的Tris-HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；

5)荧光增强液：体积浓度为3.6％的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮,0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1％的Triton X-100的混合溶液；

6)反应缓冲液：含pH为7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN₃；

7)清洗液：含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液。

2.一种利用诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法主要包括以下步骤：

1)分别取IL-33的校准品溶液和待测样品，与包被抗IL-33单抗的微孔板、反应缓冲液稀释的铕标记的抗IL-33单抗溶液混合，进行孵育，然后用清洗液进行清洗，再加入增强液；

2)采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕的荧光值，获得所述IL-33的校准品溶液和待测样品的荧光值；

3)根据IL-33校准品溶液中各IL-33的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将待测样品的荧光值代入对应的IL-33标准曲线中，便可得到所述待测样品中IL-33的含量。

3.一种检测IL-33的诊断试剂盒，其特征在于，包括包被反应板、镧系元素离子标记的抗IL-33单抗；所述包被反应板为吸附有抗IL-33单抗的微孔板；还包括校准品、反应缓冲液、洗涤液、荧光增强液。

4.根据权利要求3所述的一种检测IL-33的诊断试剂盒，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的一种检测IL-33的诊断试剂盒，其特征在于，所述镧系元素离子为Eu³⁺。

6.根据权利要求3-5任一项所述的一种检测IL-33的诊断试剂盒，其特征在于，所述荧光增强液含有β-二酮类化合物或芳香胺类化合物。