[发明专利]一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法

权利要求书

1.一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)麻醉和抗凝：取健康成年SD大鼠1只，200-350g，禁食12小时后，按0.8-1.0％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.2-0.4％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；

(2)插管：取24G Y型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1-2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；

(3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注灌注液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为50-70r/min，时间为20-30min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换灌注液灌注，流速为30-50r/min，时间为10-20min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；

(4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入20-40ml消化分散液，封口膜封口，35-40℃、90-110r/min，振荡消化20-40min，直至消化液呈匀浆状，加入20-40ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后40-100um细胞筛过滤未消化组织块1-3遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；

(5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，100-300rpm，3-5℃离心4-6min，上清重复2-4次；取上清，500-1000rpm，3-5℃离心8-12min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1300-1500rpm，3-5℃离心20-30min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，800-1200rpm，离心4-6min，1-3次，取沉淀，整个离心操作步骤均在冰上进行；

(6)细胞培养及形态观察：步骤(5)中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为1-2×10⁶细胞/ml，接种2-4ml细胞悬液至Ⅰ型鼠尾胶原过夜包被过的4-8cm培养皿，35-40℃、5％CO₂培养，KC培养50-70min后换液，HSC培养110-130min换液，之后视情况换液；

(7)存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率；

(8)细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD68细胞免疫荧光实验鉴定KC，采用油红O染色实验、α-SMA细胞免疫荧光实验鉴定HSC。

2.根据权利要求1所述的细胞原代分离、培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述按0.9％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.3％抗凝剂、0.2ml/100g体质量。

3.根据权利要求1所述的细胞原代分离、培养方法，其特征在于，步骤(3)灌注1中所述灌注液为含EGTA的D-Hank’s溶液、含0.3％抗凝剂的EGTA溶液。

4.根据权利要求1所述的细胞原代分离、培养方法，其特征在于，步骤(3)灌注1中所述灌注液为含0.3％抗凝剂的EGTA溶液。

5.根据权利要求1所述的细胞原代分离、培养方法，其特征在于，步骤(3)灌注1中所述流速为60r/min，时间为25min。