[发明专利]提高多克隆兔抗体产生的方法

权利要求书

1.一种提高多克隆兔抗体产生的方法，其特征在于：其步骤是：

步骤一、获得足够数量兔受精卵：采用超数排卵方案，选用雌性新西兰大白兔，在发情期内经肌肉注射促卵泡激素50 IU，以促进卵泡发育成熟，每12小时注射一次，连续注射3天；最后一次注射后，与公兔进行交配，将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100 IU人绒毛膜促性腺激素；在注射18-20h后，取出卵巢和输卵管放于培养皿中，使用冲卵液DPBS-BSA冲出受精胚胎，将胚胎移入培养液EBSS中，置于38.5℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育待用；

步骤二、胚胎显微注射：将体外合成的50ng/UL 的FcγRIIb-sgRNA、单链DNA和200ng/UL 的Cas9mRNA，短暂离心后混合，吸出3μL至注射针中，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵30-50枚移植到同期发情的受体母兔输卵管中，对代孕母兔提供充足的饲料和饮水，保持干净饲养环境，规范化饲养，妊娠至20天后，转至产房饲养至预产期；

步骤三、兔基因型鉴定：提取组织的DNA，进行PCR及测序，确定基因型，

PCR 引物： 上游引物：GGAGGAAGTAAATAGTGCACAGA

下游引物：GGGACTAGACTTTATCTTGGTGTC

PCR反应体系

模板 1ul

上游引物 1ul

下游引物 1ul

2X taqplus 12.5 ul

二馏水 9.5ul

反应的条件：95℃预变性5min；95 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸27s；35个循环；72℃ 延伸5min；

PCR产物测序，若在sgRNA序列的第18位的T突变成C，则证明获得单碱基突变。

2.根据权利要求1所述的提高多克隆兔抗体产生的方法，其特征在于：针对兔FcγRIIb基因序列，针对人类SLE疾病位点设计突变，设计特异性sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求1所述的提高多克隆兔抗体产生的方法，其特征在于：单链设计是依据sgRNA序列，在FcγRIIb基因序列上sgRNA序列的左右选择各加上55bp，并对sgRNA上的第18位的T突变成C，将Cas9识别的PAM（NGG）突变，通过同义突变将TGG突变成TAG，使得寡链不再被cas9识别靶向，获得的特异性的寡聚核苷酸单链序列为SEQ ID NO.2。

4.根据权利要求2或3所述的提高多克隆兔抗体产生的方法，其特征在于：鉴定兔的基因型的鉴定引物F序列为SEQ ID NO.3，鉴定兔的基因型的鉴定引物R序列为SEQ ID NO.4。