[发明专利]一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法，试剂盒包括R1、R2与R3试剂，R1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，R2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，R3试剂包括发光底物；方法包括以下步骤：将羧基修饰的微粒活化得到活化磁微粒；取活化磁微粒、血栓调节蛋白抗体混匀，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体；取活化后的血栓调节蛋白抗体、碱性磷酸酶混匀，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体；取发光底物；本发明用磁微粒作为载体，提供了近似于均相的反应体系，选用碱性磷酸酶为标记物，具有反应快速、检测结果准确、使用方法简单、测定灵敏度高、特异性强、试剂稳定性好的优点。

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法。

背景技术

血栓四项包括血栓调节蛋白、凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-a2纤溶酶抑制物复合物和组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物，这4种物质均在凝血、纤溶系统的启动阶段明显升高。其中血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）存在血管内皮细胞表面，是常用的内皮损伤伤指标之一，具有抗凝作用。血栓调节蛋白与凝血酶具有高亲和力并与之1:1结合成凝血酶-血栓调节蛋白复合物，先活化蛋白C，再在蛋白 S 的作用下使FVIIIa、FVa失活，具有抑制纤维蛋白的形成和血小板的活化作用。血栓在形成过程中往往伴有血管内皮细胞的破坏，这使血栓调节蛋白从内皮细胞表面脱落入血，从而导致血浆中血栓调节蛋白浓度升高，所以血浆中血栓调节蛋白的值可以作为评估血管内皮损伤程度和病情严重性的敏感指标。血浆血栓调节蛋白值越高，说明凝血酶浓度就越高，血栓形成的风险性也会越高。因此,检测血栓调节蛋白值对于血栓性疾病患者的病前诊断、治疗及预后评估至关重要。

目前临床上已有的检测血栓调节蛋白的方法主要是RIA法、酶联免疫吸附法和化学发光法。RIA法和酶联免疫吸附法存在明显的缺陷，其中RIA法参考值高，灵敏度低，且有放射性污染；酶联免疫吸附法检测时间长、敏感度低、特异性差、批间差等多个问题，而化学发光免疫分析技术其灵敏度和精确度与传统的RIA法和酶联免疫吸附法高出几个数量级。其以灵敏度高、特异性强、试剂稳定、监测范围宽、操作简单等优点被广大研究人员所认可，并证逐渐替代传统的生物检测技术。

血栓调节蛋白试剂在储存过程中会受多方面因素的影响，例如经过冻融后，会破坏试剂的性能，使试剂体系不稳定，从而影响测试灵敏度，同时也影响到试剂后续的长期稳定性。考虑我国南北地域跨度之大，在冬季运输过程中，因温度较低、零下温度时间过长等情况，会有存在试剂冻融的现象出现，故对试剂的运输带来较大的考验与难度，也对试剂到达客户端后的稳定性带来干扰。综上所述，提出一种灵敏度高、特异性强、稳定、抗冻融的血栓调节蛋白试剂是目前我们亟需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与R3试剂，所述R1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，所述R2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，所述R3试剂包括发光底物。

进一步地，在所述试剂盒中，优选所述磁微粒为超顺磁微粒，表面覆盖有羧基官能团，粒径为1.0-3.0µm。

进一步地，在所述试剂盒中，优选所述R1试剂还包括用于保存磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的第一保存液，所述第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.01-0.05% Proclin 300，余量为200-600mM的Tris-HCl缓冲液，所述第一保存液的pH为7.2-7.4。