[发明专利]高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用

说明书

本发明提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，将FLIPR系统成功地应用到了植物钙信号的检测中，增加了FLIPR系统在植物钙信号检测中的用途。同时，本发明提供的基于FLIPR检测植物钙信号的方法，对外源钙信号CaCl₂溶液刺激植物所产生的钙信号变化进行检测，为实现植物钙离子高通量实时荧光检测奠定了基础。

技术领域

本发明属于植物细胞检测技术领域，具体涉及高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用。

背景技术

高通量实时荧光检测分析系统FLIPRTETRA是MolecularDevices公司最新推出的高通量CCD成像读板机，是一台将加液系统和检测系统完美整合的仪器，也是目前GPCR定量检测仪器中唯一能将高通量和高质量完美结合的仪器。高通量实时荧光检测分析系统FLIPR TETRA用于检测GPCR受体和离子通道活动，使得在药物筛选初期可靠、灵活、高通量筛选先导化合物成为可能。

目前国内外对于FLIPR的应用仅限于心肌细胞缺氧损伤、采用FLIPR Calcium4试剂盒检测药物对胞浆内钙离子浓度变化的影响、采用FLIPR钙分析法检测化合物对内皮素-1(endothelin-1，ET-1)激活高表达内皮素受体的CHO细胞内钙升高的抑制作用、离子通道结构和功能的筛选等医学和动物领域，植物领域鲜有报道。

钙作为植物体内第二信使广泛参与了植物响应的各种非生物和生物胁迫的信号传导，植物细胞利用胞内的钙离子作为媒介可以响应外界的环境变化，植物细胞感知胞外环境变化后，会编码特异的“钙指纹”，被胞内钙离子感受器识别后，通过“解码”过程启动下游各种生理反应来应对环境变化。多年来，钙信号及其对植物的发育及其生理生化过程的相关研究一直为本领域中的研究重点，因而对于本领域来讲，研发一种可检测植物钙信号的方法对于推进植物钙信号的相关研究是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用。本发明成功地将FLIPR系统应用到了植物钙信号的检测中，为实现植物钙离子高通量实时荧光检测奠定了基础。

本发明提供了高通量实时荧光检测分析系统FLIPR在植物钙信号检测中的应用，所述植物包括报春花属植物、缬草属植物、烟草属植物和拟南芥属植物。

优选的，所述报春花属植物包括报春花，所述缬草属植物包括缬草，所述烟草属植物包括烟草，所述拟南芥属植物包括拟南芥。

本发明还提供了一种基于FLIPR检测植物钙信号的样本前处理方法，包括如下步骤：

将植物原生质体与钙染料混合，得到第一混合物；

将所述第一混合物与钙信号螯合剂和外源钙信号刺激溶液混合，将得到的第二混合物孵育和第一离心，得到待上机样本。

优选的，所述植物原生质体与钙染料的体积比为(0.1～10)：(0.5～5)。

优选的，所述钙信号螯合剂包括EGTA溶液、乙二胺或2，2'-联吡啶；所述外源钙信号刺激溶液包括CaCl₂溶液、CaCO₃或Ca₂NO₃。

优选的，当所述钙信号螯合剂为EGTA溶液，所述外源钙信号刺激溶液为CaCl₂溶液时，所述EGTA溶液和CaCl₂溶液体积总和与第一混合物的体积比为(0.1～6)：(1～15)。

优选的，所述EGTA溶液的摩尔浓度为5～200μM；所述CaCl₂溶液的摩尔浓度为220～450mM。

优选的，所述植物原生质体的提取方法包括如下步骤：

将植物组织与裂解液混合，裂解5～7h，过滤和第二离心，得到植物组织裂解物；