[发明专利]一种检测pH和ONOO-荧光探针及其合成方法与应用

说明书

本发明公开了一种检测pH和ONOO^‑荧光探针及其合成方法与应用，该荧光探针是由具有独特螺旋环结构的罗丹明和花菁骨架通过二烯键连接而成。其中罗丹明作为分子荧光响应以及pH敏感部分，花菁共轭骨架使其发射波长转移到近红外区，排除了细胞和组织自身荧光的干扰，而ONOO^‑通过氧化双键引起的光谱性质可以实现其检测。本发明通过颜色变化、紫外‑可见吸收光谱法、荧光光谱法研究了其对pH和ONOO^‑的检测效果，结果表明该探针对pH值有很高的灵敏度，且能够高效选择性识别ONOO^‑。

技术领域

本发明属于活性氧检测技术领域，涉及一种用于检测细胞内pH以及内源性ONOO^-荧光分析的方法策略。更具体地，涉及一种荧光探针的合成方法及其在检测pH和ONOO^-中的应用。

背景技术

细胞内pH值是一个重要的生物参数，在细胞代谢、离子转运和细胞内吞噬等生理过程中发挥着重要作用。特别是溶酶体作为细胞循环的中心，其pH值的异常可导致功能缺陷，导致各种疾病。

类风湿关节炎(RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要特征的自身免疫性疾病，其病理基础为滑膜炎。RA的全球患病率在0.5％到1％之间，大约80％的RA患者为女性。目前类风湿关节炎还不能治愈，但及时规范的诊断和治疗可以达到规范治疗。RA早期主要表现为活性氧ROS增加，炎症周围pH降低，且ROS与RA临床指标有一定的相关性。因此，环境pH和ROS可作为RA初始检测的生物标志物。过氧亚硝酸盐ONOO^-作为活性氧的一种，现有研究表明，ONOO^-直接参与RA患者的组织损伤和进一步的组织破坏。因此，为防止RA的进一步发展，建立RA的早期诊断方法是十分必要和迫切的。

因此，如何建立一种性能良好的pH敏感型ONOO^-检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题，有望实现RA的早期精准检测。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种实现pH和ONOO^-双检测的荧光探针及其合成方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测pH和ONOO^-的荧光探针，所述荧光探针的结构式为：

所述荧光探针分子中含有独特螺旋结构的罗丹明作为分子荧光响应和pH敏感部分。然后，通过二烯键连接花菁骨架，将罗丹明的发射波长转移到近红外区，以排除细胞和组织自荧光的干扰。该荧光探针可以通过荧光检测设备进行可视化鉴别，也可进入活细胞中对细胞内pH和内源性ONOO^-进行测定。

本发明的另一目的是提供一种实现pH和ONOO^-双检测的荧光探针的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测pH和ONOO^-荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)将环己酮加入浓硫酸中，在冰水浴中搅拌；然后加入2-(4-二乙基氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸，于90℃加热回流2h；冷却至室温后，将产品倒入冰水中并加入高氯酸沉淀，然后减压抽滤，同时用冰水冲洗；最后，真空干燥得到中间产物A；

(2)将2,3,3-三甲基-3H-吲哚和碘乙烷溶于甲苯中，在100℃下反应22h，冷却至室温，过滤收集固体；用甲苯和乙醚洗涤后经真空干燥得到化合物B；

(3)在NaOH溶液中加入化合物B，混合物在50℃下加热并剧烈搅拌2小时，反应液用乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸钠在有机相上干燥，减压蒸馏除去溶剂得化合物C；