[发明专利]一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法

说明书

本发明涉及一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，包括步骤：(1)选取紫花苜蓿种子，灭菌消毒后移入种子培养基，诱导种子萌发至长出两片子叶；(2)切下子叶移入诱导培养基诱导产生愈伤组织；(3)将(2)中愈伤组织移入丛生诱导培养基，诱导产生丛生芽；(4)将(3)中诱导产生的丛生芽移入生根培养基，诱导其分化生成完整植株；(5)移栽分化所需时间最短的完整植株。本发明获得的组培苗材料能使紫花苜蓿组培繁殖周期从常规的6～7个月缩短到4个月，且分化能力强，能在短时间内得到大量优质的紫花苜蓿植株。

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，尤其是涉及一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法。

背景技术

紫花苜蓿是优质的多年生豆科牧草，产草量高、营养丰富、蛋白含量高、抗性强、适应性广，被誉为“牧草之王”，在现代畜牧业及奶业发展中具有举足轻重的地位。紫花苜蓿还能够固氮增肥、改良土壤及保持水土，具备的生态功能在农业可持续发展方面也具有重要价值。近年来尽管我国紫花苜蓿种植面积逐步扩大，但总产草量仍不能满足国内需求，畜牧业和奶业的发展严重依赖苜蓿商品草的进口。为摆脱苜蓿产业发达国家对我国苜蓿草产业的控制，发展我国苜蓿产业，开展提高紫花苜蓿的产量和品质的研究势在必行。紫花苜蓿组织培养的方法体系，是进行遗传育种、突变体诱变和农杆菌介导的遗传转化等研究实验使用最为广泛和重要的技术过程。紫花苜蓿组培苗获得的时间、质量和效率，直接影响甚至限制了相关研究的开展。参照目前常规的技术方法，紫花苜蓿组培苗的完整获得时间为6～7个月，实验周期长、分化慢、速率低，导致试验投入的时间长、人力和组培成本耗费大，限制了紫花苜蓿分子遗传育种和基因分子功能等方面的研究发展。

中国专利CN102499094A公开了一种提高紫花苜蓿组织培养效率的方法，重点对培养步骤中种子消毒和愈伤组织形成与分化两大技术节点进行改进与创新，通过采用升汞与双氧水复合消毒法，实现既消毒效果彻底，污染率低，又对种子损伤最小的目的，最终解决当前外植体污染严重的问题；同时，首次采用TDZ+6-BA配合使用的方法，不仅可以显著提高愈伤诱导率、形成速率，提高愈伤质量，而且还最大限度保留了愈伤组织的分化能力，促进胚状体芽的形成，从而获得高效、省时、低毒、低褐化的苜蓿组培新技术方法。但是其采用了多种无机化学试剂，易对生物材料紫花苜蓿本身以及对环境产生污染，尤其是其使用了含汞物质，毒性很强，不利于紫花苜蓿材料的生长和利用。

发明内容

针对上述背景中的问题，本发明提供一种紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，筛选得到的紫花苜蓿材料组织培养周期从6～7个月缩短到4个月，并且愈伤组织诱导分化能力强，质量好，速度快，以解决紫花苜蓿组织培养周期长、速度慢等问题。

本发明的紫花苜蓿组培快速分化植株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将若干紫花苜蓿种子灭菌消毒，移入种子培养基中，在25℃的培养箱中暗培养2天后，移入光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱培养4～5天，使种子萌发出子叶；

(2)将子叶切下移入诱导培养基诱导产生愈伤组织，在25℃的培养箱中暗培养27～40天，得到愈伤组织；

(3)将得到的愈伤组织移入丛生诱导培养基诱导产生丛生芽，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养14～15天，得到丛生芽；

(4)将得到的丛生芽移入生根培养基，在光照16h/24℃，黑暗8h/20℃，光照强度4000～4200lx的培养箱中培养60～77天，得到完整植株；

(5)将(4)中最快分化出的完整植株移栽至营养土中，盖保鲜膜在光照16h/22℃，黑暗8h/20℃，光照强度6700～7500lx的温室中炼苗2天，之后揭掉保鲜膜继续在相同环境中培养。

本发明所述的方法，其中所述紫花苜蓿种子优选的是采用中苜4号种子，在组培时，尽量采用大批量的种子如1000粒来进行，更为容易筛选出分化最快的组培苗材料。