[发明专利]一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法

说明书

本发明公开了一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，通过采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈，在光强频谱上执行半空间傅里叶滤波或等效的三维希尔伯特变换，结合非干涉合成孔径，从而实现了基于非干涉测量下无需满足匹配照明条件的衍射层析成像。由于固有的合成孔径优势，使得成像分辨率达到非相干成像衍射极限，获得了高分辨率成像结果。采用非干涉测量，成像光路简单，光学路径稳定，成像结果不受散斑和寄生干涉影响，并且可高度兼容传统明场显微镜结构。

技术领域

本发明属于光学显微测量、三维折射率成像技术，特别是一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法。

背景技术

在生物医学显微成像领域，大部分活细胞和未染色的生物标本都是无色透明的，这是因为细胞内各部分细微结构的折射率和厚度不同，当光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，但这种相位差人眼无法观察。这就需要通过一些化学或者生物手段来对细胞进行染色或标记，从而使其在显微镜下可见。在过去的几十年里，开发了多种荧光显微成像方式，如宽场、共聚焦、全内反射荧光、双/多光子和光片荧光显微镜技术，它们被作为探测非常微弱的信号和揭示固定或活细胞的三维结构和功能特性的强大工具，具有很高的特异性。在这些技术中，附着在特定分子结构上的荧光标记物被短波长激光激发后辐射出长波长荧光，从而可对原本透明的生物样本进行成像。进入21世纪以来，超分辨荧光显微技术突破了衍射极限,将成像分辨率提升至几十纳米，为亚细胞尺度的研究提供了技术手段。目前的超分辨荧光显微成像方法有受激发射损耗显微成像(STED)、结构光照明显微术(SIM)、随机光学重建显微术(STORM)以及光激活定位显微术(PLAM)等。然而，这些技术不适合成像非荧光样品，或可视化不能被荧光分子标记的细胞成分，从而限制了荧光显微技术的应用范围。此外，外源性荧光剂带来的光毒性可能会对细胞活性等细胞功能产生不可逆的负面影响，而相关的光漂白性会在一段较长的时间内阻止活细胞长时间成像。

近年来，为了简化样本制备过程、消除荧光分子对待测样品的干扰并满足临床的成像需求，无标记光学成像成为了生物医学显微成像研究的热点，相衬显微镜利用折射率作为本征光学成像对比度，在不使用外源性标记剂的情况下对生物样品进行无标记成像。其中二维无标记成像，测得的数据只是待测物体沿轴向的光吸收或光程差积累，反映样品信息的折射率与厚度信息相互耦合，无法得到三维信息。为了获得更准确的形态学信息，如体积、形状、干质量等，生物样本的无标记三维成像成为目前研究的一大热门方向。

光学全息术的引入使得测量由样品引起的微小相位差成为可能，促进了相位成像技术从定性观察到定量测量的发展。将光学全息术与计算机断层扫描相结合，通过物体旋转或照明扫描，目前已经开发出了各种光学衍射层析成像方法用以推断生物样品的三维折射率分布。特别是光学衍射层析使三维无标记显微镜成为可能，并已成功应用于研究血细胞、神经元细胞、癌细胞、细菌等各种类型的生物样品。然而，基于干涉的光学衍射层析通常使用时间相干照明光源，使得成像结果中存在散斑噪声，阻碍了高质量图像的形成。此外，它们大多数都需要采用具有复杂光束扫描装置的干涉装置，这妨碍了它们在生物和医学领域的广泛应用。

为了弥补基于干涉测量的光学衍射层析成像方式的缺点和不足，推动三维折射率成像在生物医药领域中的应用，各种基于非干涉测量的层析成像技术在近几年逐渐发展起来。由于采用基于非干涉的测量方式，相机上只有散射场的光强数据被记录，而相位信息完全丢失，因此无论对于二维定量相位成像还是三维衍射层析成像，所有基于聚焦探测的非干涉测量成像方式都需要满足匹配照明条件(照明数值孔径等于物镜数值孔径)，才能实现相位或折射率信息的正确恢复。然而，在实际应用中很难严格实现匹配照明条件，特别是对于高数值孔径显微系统，若采用油浸物镜，则必须借助聚光镜才有可能实现照明条件的匹配。在不满足匹配照明条件的情况下，由于捕获的强度频谱中低频频谱存在重叠，导致无法完整恢复相位分量，也就是说，不能正确恢复样品的三维折射率。所以，如何规避匹配照明条件，即在任意照明下都能实现基于非干涉测量的衍射层析成像，精确重建待测样品的三维折射率分布，并且能达到非相干衍射极限成像分辨率是一大技术难题。

发明内容