[发明专利]一种基于BRET的磷酸盐生物传感器、构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于BRET的磷酸盐生物传感器、构建方法及其应用，该生物传感器为由对磷酸盐特异性响应的铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白Pa PBP、纳米荧光素酶NanoLuc和黄色荧光蛋白VenusΔC10融合得到的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白Pa PBP与纳米荧光素酶NanoLuc及黄色荧光蛋白VenusΔC10均通过柔性肽接头连接，铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白Pa PBP，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明构建的生物传感器对磷酸盐具备极强的选择性，通过耦合生物发光共振能量转移技术，能够将磷酸盐浓度信号转换为比率荧光信号输出，实现对磷酸盐的快速、灵敏和高通量检测，该生物传感器适用于对自来水、地表水和城市污水等不同环境水体中磷酸盐检测。

技术领域

本发明属于环境生物领域，特别涉及一种基于BRET的磷酸盐生物传感器、构建方法及其应用。

背景技术

磷是导致水体富营养化的主要因素之一。随着不断增加的工农业磷排放，给水环境带来了巨大威胁，亟需建立针对水体磷酸浓度的快速、灵敏和高通量方法，提高环境监测的效率，进而更有效的防范富营养化危害。然而现有的磷酸盐检测方法存在诸多不足之处：传统的比色分析对低浓度样品不灵敏，耗时长且使用有毒化学试剂；色谱分析需要昂贵的设备和专业的操作；电化学传感器容易受到杂质的严重干扰；纳米酶传感器容易引入有毒污染物。因此，有必要研发特异性强、快速、高通量、环境友好的磷酸盐检测新方法。

近年来，基于生物发光-共振-能量转移(BRET)的生物传感器由于其灵敏度高、能避免光漂白和自体荧光等优点已被广泛应用于医学、食品等领域。BRET生物传感器由与配体特异性结合的敏感(识别)元件、生物发光供体及荧光受体组成。由于生物传感器与配体结合后会发生构象变化，影响生物传感器的光学性质，通过建立光学性质与配体浓度的相关关系即可实现配体化合物的识别与检测。

在细菌中，磷酸盐特殊转运系统(phosphate specific transport，Pst)是无机磷酸盐(Pi)吸收转运的关键系统。Pst系统一般由PstS、PstC、PstA、PstB和PhoU5个蛋白组成。其中，磷酸盐结合蛋白PstS，为Ⅱ型外周质结合蛋白，该蛋白与无机磷酸盐(Pi)具有极高的亲和性，负责感知和结合周质空间的Pi；该蛋白包括2个相似的球状结构域和一个磷酸盐结合位点。其中，2个球状结构域是PstS蛋白的基本骨架，中间以双铰链连接。磷酸盐结合位点是PstS蛋白的活性中心，位于2个球状结构域中间(缝隙)。该结合位点由10个氨基酸组成，与球状结构域中的1,2,6-α螺旋的N末端相连，可通过氢键和疏水作用与非溶剂化的Pi结合，当其与Pi(配体)结合时会发生很大的构象变化，因此可以作为磷酸盐生物传感器的敏感元件。不同菌株的PstS蛋白的结构大致相同，其不同之处主要是PstS蛋白N端环状结构的有无，相关研究表明，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)磷酸盐结合蛋白PstS的N端含有该环状结构。

纳米荧光素酶(NanoLuc)是一种来自深海虾的工程化萤光素酶，是一种体积小(19kDa)、亮度高但稳定的蛋白质，与其他萤光素酶相比，它产生增强和持续的发光。因此，NanoLuc可用于作为构建BRET生物传感器检测的的生物发光供体。

发明内容

本发明通过对磷酸盐生物传感器进行设计，旨在提供一种基于BRET的磷酸盐生物传感器、构建方法以及应用，通过以铜绿假单胞菌磷酸盐结合蛋白PstS作为敏感元件，以纳米荧光素酶NanoLuc为生物发光供体，以黄色荧光蛋白VenusΔC10为荧光受体，构建了一种用于水体中磷酸盐检测的生物传感器，利用纳米荧光素酶NanoLuc能够催化底物呋喃嗪产生460nm的生物发光，并通过共振能量转移激发黄色荧光蛋白VenusΔC10产生528nm的发射光，当生物传感器结合磷酸盐后会发生构象变化，导致纳米荧光素酶NanoLuc与黄色荧光蛋白VenusΔC10的BRET比率改变，且BRET比率变化的数值与结合的磷酸盐浓度呈线性相关，由此可实现对磷酸盐的精准检测，从而解决现有磷酸盐检测方法存在化学试剂污染大、反应时间长、操作步骤繁琐、灵敏度低等缺陷。