[发明专利]一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的制备方法，其特征在于，用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂包括固定化微生物体和生物促生剂，所述固定化微生物体包括微生物和改性生物炭，所述微生物包括东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，所述改性生物炭为由5.5mol/L HNO₃改性的废弃核桃壳；所述生物促生剂包括碳源、营养蛋白、氨基酸和生物酶；包括以下步骤：

步骤1.菌株的筛选

a.富集：采集农村黑臭水体的黑臭底泥低温密封保存，取1g底泥于10ml无菌水中，充分震荡得到底泥悬浮液；吸取5ml底泥悬浮液于牛肉膏蛋白胨培养基中进行富集培养24h；吸取5ml富集培养液于牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h，重复培养3次；培养条件为30℃，120r/min；

b.初筛：吸取最后一次富集培养液，依次稀释为1：10、1：10²、1：10³、1：10⁴、1：10⁵稀释液，分别吸取1：10³、1：10⁴、1：10⁵稀释液0.2ml涂布于分离平板，30℃恒温培养1~2d，挑取生长速度快、形态不同的菌落接种到分离培养基进行划线纯化，得到10株初筛菌株；

c.复筛：将初筛得到的单菌株接种到LB培养基中活化24h，活化条件为30℃，120r/min；取10ml各菌株活化培养液接入100ml黑臭水样中培养24h，测定水样中COD和NH₄⁺-N浓度，选择3株高COD和NH₄⁺-N降解率的菌株作为目标菌；

步骤2.菌株的16S rDNA测序鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，利用27F/1492R引物对筛选获得的菌株DNA进行PCR扩增；在NCBI数据中的Blast比对系统中输入测序得到的序列信息，查找数据库中相似性较高的序列，应用MEGA7.0软件进行聚类分析并构建系统发育树；通过菌株的系统发育树，鉴定3株菌分别为东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；

步骤3.复合菌液的制备

测定东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生长曲线，选择对数增长期增长到80%的时间点作为最佳培养时间，将此时间点的菌液作为种子液，此时微生物繁殖速度快，代谢能力强；按照最佳培养时间在LB培养基中培养菌株，吸取活化培养液10ml，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入10ml灭菌0.86% NaCl摇匀，再次离心10min弃去上清液，最后用10ml灭菌0.86% NaCl洗下沉淀制成各菌株种子液；东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的种子液按照体积比2：1：2复配为复合菌液，备后续使用；

步骤4.改性生物炭的制备

取废弃核桃壳清洗烘干，使用破碎机破碎至1~2mm，置于马弗炉中，700°C下裂解2h后利用去离子水反复清洗，75℃烘干，过60目筛得到生物炭；将生物炭放入5.5mol/L HNO₃溶液中，浸泡12h得到改性生物炭；获得的改性生物炭用去离子水淋洗，放置105℃烘箱中干燥24h，备用；

步骤5.固定化微生物体的制备

称取1g改性生物炭，高压灭菌冷却后加入200ml复合菌液中，置于恒温振荡培养箱中振荡培养24h，培养条件为：30℃、150r/min；取出后静置，无菌水淋洗过滤，得到固定化微生物体；

步骤6.固体微生物制剂的制备

称取2g生物促生剂与步骤5制备的1g固定化微生物体混合，获得固体微生物制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述东洋芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌数独立为（1~1.5）×10⁵ CFU/mL。

3.如权利要求1所述的制备方法制备的用于治理农村黑臭水体的固体微生物制剂的应用，其特征在于，采用间歇曝气，曝气量0.5-1L/min，每天曝气4-6h；所述固体微生物制剂的投放量为2.5-4.5g/L。