[发明专利]一种香豆素类比率型荧光探针及其制备方法与应用方法

权利要求书

1.一种香豆素类比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将2,4-二羟基苯甲醛、4-氯苯乙酸、三乙胺和醋酸酐混合后进行反应，反应产物顺次进行静置抽滤、水洗、干燥，得中间产物；

(2)将中间产物、浓盐酸和丙酮混合后进行反应，反应产物顺次进行静置抽滤、干燥、纯化，得到荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素；

(3)将荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素、缚酸剂、4-二甲氨基吡啶和二氯甲烷混合，再将4-溴丁酰氯的二氯甲烷溶液滴入混合液中反应，得到香豆素类比率型荧光探针；

所述香豆素类比率型荧光探针的结构式为：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，2,4-二羟基苯甲醛、4-氯苯乙酸、三乙胺和醋酸酐的摩尔比为1:1～2：2～4：5～100；所述反应的温度为80～150℃，反应的时间为5～10h。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，中间产物在丙酮和浓盐酸混合液中的质量分数为1～20％，所述丙酮与浓盐酸的体积比为1:1～3，浓盐酸的浓度为8～12mol/L；所述步骤(2)反应的温度为60～100℃，反应的时间为4～10h。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素、4-溴丁酰氯、缚酸剂的摩尔比为1:1～2：2～4；所述荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为5～20:1，混合液中荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素与二氯甲烷的质量体积比为0.1g：15～25mL。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶中的一种或几种。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述4-溴丁酰氯的二氯甲烷溶液中4-溴丁酰氯的浓度为0.05～0.15mol/L。

7.权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的香豆素类比率型荧光探针，其特征在于，所述香豆素类比率型荧光探针的结构式为：

8.权利要求7所述的香豆素类比率型荧光探针检测肼含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将肼的缓冲溶液和香豆素类比率型荧光探针COCB混合，得到含有探针COCB的标准溶液；

(2)测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为350nm，以肼浓度为横坐标，以I₄₈₀/I₄₂₀为纵坐标，建立标准曲线；

(3)向待测样品中加入探针COCB，控制其浓度与所述标准溶液中探针COCB的浓度相等，测定其在激发波长为350nm激发光下的荧光发射光谱，根据标准曲线计算得出待测样品中肼的含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述标准溶液的pH值为4～11；标准溶液中探针COCB的浓度为0.1～10μM；标准溶液中肼的浓度为0.1μM～1mM。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或HEPES缓冲溶液。