[发明专利]一种阿尼芬净前体棘白菌素B高产菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种产棘白菌素B菌株高效诱变和快速筛选的方法。首先通过常压室温等离子体(ARTP)诱变，然后通过抑菌圈法筛选初筛、摇瓶发酵复筛和发酵优化试验后，获得了一株高产、稳定性强的菌株ARTP‑7，该菌株棘白菌素B产量达到1.8g/L，比诱变前提高了240％。将ARTP诱变和抑菌圈初筛结合使用，显著提高了菌株的筛选效率，结合发酵优化，实现了棘白菌素B突变菌株的快速筛选。

技术领域

本发明涉及微生物育种技术领域，特别涉及ARTP诱变技术，是一种高产棘白菌素B菌株的诱变选育方法，尤其涉及通过上述方法筛选到的一种阿尼芬净前体棘白菌素B高产菌株及其应用。

背景技术

棘白菌素类药物是一种新型抗真菌药物，通过抑制β-1,3-葡聚糖合成酶活性来干扰真菌细胞壁的合成，哺乳动物细胞没有细胞壁，因此该类药物的毒副作用小，且安全性高，对念珠菌属、曲霉菌属及部分对唑类耐药的真菌类均有抗菌活性。现已获得批准上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净(2004年在美国上市)、米卡芬净(2005年在日本上市)和阿尼芬净(2006年在美国上市)，它们都具有相似的非核糖体六元环肽类母核结构，差异仅在于侧链基团、氨基酸连接顺序和后修饰基团的不同。其中卡泊芬净和米卡芬净已在国内上市，阿尼芬净由于产量低，市场售价高，临床中的应用推广受到了一定的影响，具有广阔的市场前景。

阿尼芬净的工业生产包括三个过程，首先是由Aspergillus nidulans发酵合成前体化合物棘白菌素B，然后再经过犹他游动放线菌发酵水解掉脂肪链，最后通过化学方法加上一个人工合成的侧链获得阿尼芬净。其中，Aspergillus nidulans发酵合成阿尼芬净前体棘白菌素B是工业生产的第一步，也是整个工艺的关键核心。高性能的发酵菌株是控制生产成本的关键因素，也是限制该行业准入的技术门槛。目前，国内外学者提升棘白菌素B发酵水平的研究主要着眼于诱变育种、发酵优化与调控和代谢工程。但是，进一步的系统分析发现核心途径可供理性改造的靶点有限，相较于理性改造，诱变育种的随机性特点在菌株综合发酵性能改良时更能发挥出优势，尤其是对于相对复杂的多细胞微生物，所以目前工业生产使用的绝大多数放线菌和丝状真菌菌株都是通过诱变育种获得的。有效微生物育种方法的缺乏使棘白菌素B产量的进一步大幅度提高受到限制，为了适应工业化生产要求，需要通过合适的遗传育种手段快速提高棘白菌素B生产菌株的发酵水平。本发明通过ARTP诱变、抑菌圈法初筛、摇瓶发酵复筛和发酵优化后，获得了一株高产、稳定性强的菌株。

发明内容

本发明提供了一株高产棘白菌素B的菌株，所述菌株为构巢曲霉(Aspergillusnidulans)ARTP-7,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40073，保藏日期为2022年1月29日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

在一个实施方式中，本发明所述菌株的诱变条件输出功率100W，照射距离1mm，气体流速10L·min^-1，样品量10μL，通入气体为氦气，处理时间60s-540s，最佳诱变时间180s。

另一方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包括上述菌株。

在一个实施方式中，所述菌剂为液体制剂或固体制剂。

另一方面，本发明还提供了一种微生物培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将上述菌株使用培养基进行培养，并收集含有上述菌株的培养物。

另一方面，本发明还提供了上述菌株或菌剂在生产棘白菌素B中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种制备棘白菌素B的方法，所述方法包括对上述菌株进行发酵的步骤。

在一个实施方式中，上述发酵的温度为20℃-40℃，优选，25℃；上述发酵的时间为2d-20d，例如，10d-15d。