[发明专利]一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体

说明书

本发明公开了一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体，属于生物技术领域，通过青海血蜱的RNA样本反转录出第一链的cDNA，然后通过5'RACE和3'RACE技术扩增得到青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长序列，并进行核苷酸序列的测定，而后通过携带基因序列的克隆载体进行基因编码区的克隆；通过宿主菌进行原核表达，制备编码青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的蛋白抗原，并确定其氨基酸序列；获得纯化后的青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂后，用其免疫BALB/c小鼠，3次免疫之后，使用抗原亲和纯化的方法获得针对青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂的特异性多克隆抗体，为疫苗的研发做准备。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体。

背景技术

青海血蜱是硬蜱科血蜱属的一种蜱虫，为体外吸血性寄生虫。分布于我国青海、甘肃、云南、西藏等地，是青海省的优势蜱种。青海血蜱可以传播诸如立克次氏体、巴贝斯虫、泰勒虫、Q热、莱姆病等多种疾病。发病动物多表现为发食欲不振、体型消瘦、发热、贫血、黄疸及血红蛋白尿症，死亡率高。

青海血蜱随季节的变化会出现卵、幼蜱、若蜱和成蜱的发育过程，往往在6-8月达到寄生的高峰期，根据其季节动态和在减少通过蜱的侵袭及其后果的尝试中，人们已经发现并应用了一些效果较好的驱蜱、杀蜱药剂，大多以喷雾、涂抹、浇泼、药浴的方式使用，如有机磷类药物、拟除虫菊酯类药物、DDT、氨基甲酸酯等药物，也有的使用了如伊维菌素等广谱驱虫药物。

这些药剂的使用能达到一定程度的驱蜱效果，但也有缺点，主要在于用药过程中对宿主、对环境、对寄生虫以及对人类自身的一些影响：体外用药过程中，药物本身对宿主和人会产生毒性作用，用完的药物会污染环境，重复用药的需求增加了人力和物力的成本，同时所用的药物会使寄生虫产生耐药性，因此用药过程中还要考虑轮换用药、穿梭用药的原则。

近年来，作为化学抗寄生虫药的可选替代，疫苗的研发成为热门选项，它不仅效果好、副作用少、而且成本也较低，但是暂时没有对青海血蜱疫苗的研究。通过转录组雌雄蜱肠道差异基因的对比，大量筛选获得到较为重要的一个新基因，即丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)基因，其他蜱种丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究方向主要集中在抗凝血机制、血液消化机制、调节发育生殖、细胞凋亡、抗炎症反应以及病原体传播等多重功能，但在青海血蜱中尚无任何报道，为解决青海血蜱的防控问题提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂及其多克隆抗体，以解决背景技术中的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂(Hqipin1)，通过青海血蜱的RNA 样本反转录出第一链cDNA，然后通过5'RACE和3'RACE技术扩增得到青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因并进行核苷酸序列的测定，而后通过携带基因序列的克隆载体进行基因的克隆；通过宿主菌进行原核表达，制备编码青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的蛋白抗原，并确定其氨基酸序列；用获得的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过一系列方法制备出多克隆抗体，为疫苗的研发做准备。

青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的获得：利用聚合酶链式反应(PCR) 的方法，以青海血蜱的cDNA为模板，经PCR扩增得到青海血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，该基因序列如下所示：