[发明专利]一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用

说明书

本发明公开了一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备：将供试品粉末水洗，留残渣；向药渣中加入变性缓冲液和0.50mol/L二硫苏糖醇溶液，反应溶解，再加入0.55mol/L碘代乙酰胺溶液避光反应；将反应后的混合液置于截留分子量为3kD的超滤离心管中作离心处理；向超滤膜上方的截留物中加入胰蛋白酶溶液；再次离心，鹿茸多肽穿过超滤膜转移至膜下而被收集，用于仪器分析；高效液相色谱‑质谱联用检测。本发明的鉴别方法可以准确将脑灵素制剂中的梅花鹿茸和马鹿茸与其它掺伪品种区别开来。

技术领域

本发明涉及药品检测领域，具体涉及脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用。

背景技术

鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，为药用历史悠久的补益类中药，除作饮片用外，鹿茸还作为原料制成中成药制剂。在巨大的市场需求下，梅花鹿茸、马鹿茸原料短缺，价格昂贵，原料供应远远不及生产量的需求。市场常出现以驼鹿、驯鹿、狍鹿等其他物种掺伪投料的现象，使相关产品的质量和安全性难以保证。

现行的鹿茸标准中，没有收载针对物种特异性的辨别方法，在鹿角胶质量标准中收载了鹿源性特征多肽的鉴别方法，该方法可以区分鹿科动物整体与牛科、马科等其它科哺乳动物，但却无法将梅花鹿、马鹿与其它非标鹿种分开，这就导致驼鹿、驯鹿、狍鹿等物种冒充梅花鹿、马鹿时无法精准判断。

脑灵素制剂是神经科常用中成药，主要用于神经衰弱，健忘失眠，头晕心悸，身倦无力，体虚自汗，阳痿遗精等症状。其处方由15味药材组成，其中包括鹿茸、鹿角胶两味来自于鹿源的贵细药材，作为方中佐药，发挥补肝肾、益精血的作用。由于鹿茸和鹿角胶的动物来源相同，两者的蛋白组成存在较高比例的交叉，因此当两味药材同时存在时，鹿角胶的蛋白成分会对鹿茸的鉴别造成干扰，难以判断制剂中是否有正确的鹿茸投料。

脑灵素制剂中的鹿茸为粉末直接入药，但是在处方中占比低至0.3％，采用常规的煎煮、回流、超声等通用提取方式，无法将蛋白成分从鹿茸药材中提取出来，若采用高温高压提取方法，则鹿茸中的热不稳定蛋白会被破坏；另外过于复杂的基质成分将会对鹿茸的离子对检测造成极大的影响，以致于目标信号被基质完全淹没，导致假阴性结果的出现，从而对药材投料情况造成误判。

发明内容

基于上述现有技术的问题，本发明提供了一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法及其应用，该鉴别方法可排除鹿角胶对鹿茸造成的干扰。

为了实现上述技术效果，本发明通过以下技术方案：

一种脑灵素制剂中微量鹿茸多肽的鉴别方法，包括以下步骤：

供试品溶液的制备：将供试品粉末水洗，留残渣；向药渣中加入变性缓冲液和二硫苏糖醇溶液(优选：0.50mol/L)，反应溶解(优选的：在75-85℃下进行反应，更优选：80℃下反应)，再加入碘代乙酰胺溶液(优选：0.55mol/L) 避光反应；将反应后的混合液置于超滤离心管(优选：截留分子量为3kD)中作离心处理；向超滤膜上方的截留物中加入胰蛋白酶溶液；再次离心，鹿茸多肽穿过超滤膜转移至膜下而被收集，用于仪器分析；

高效液相色谱-质谱联用检测。

优选的，色谱条件如下：色谱柱ACQUITYBEH C₁₈(2.1×100mm，1.7 μm)，流速0.3ml/min，流动相A为0.1％甲酸乙腈，溶液B为0.1％甲酸溶液，进行梯度洗脱，0～25min流动相A(％)3→20，流动相B(％)97→80，25～40min 流动相A(％)20→50，流动相B(％)80→50。

优选的，质谱条件如下：采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI⁺)，进行多反应监测(MRM)，检测离子对如下：母离子605.0，子离子1169.1，子离子2275.1。