[发明专利]一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法

说明书

本发明公开了一种细胞穿膜肽‑目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法，本发明可实现高效地转运外源目的蛋白至链霉菌活细胞的目的，且对细胞活性不产生显著影响。该方法可帮助目的外源蛋白高效地跨越革兰氏阳性菌复杂的细胞壁和细胞膜屏障，有助于通过此方法介导外源蛋白高效进入链霉菌活细胞，以对细胞基因表达调控、代谢物产量监测等进行活细胞水平或可视化水平研究。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备及其高效导入链霉菌活细胞的方法。

背景技术

细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide，CPP）是一类由约5至30个氨基酸组成的短肽，其可以作为活细胞物质载运系统，通过共价或非共价偶连的方式携带目的蛋白、核酸、纳米材料等穿透动物细胞的生理屏障细胞膜，并在一定浓度内对细胞活性产生影响较小。目前，CPP已较为广泛地应用于以胞内分子为靶标的非侵入性药物递送工具。近年来的研究表明，CPP不仅能携带寡核苷酸、小干扰RNA、质粒、纳米材料等克服动物细胞细胞膜，而且能将小干扰RNA或质粒等载运至含有细胞壁结构的高等植物、藻类和微生物细胞中，但相关报道尚较为少见。

目前已有的穿膜肽介导“货物”向微生物活细胞转运的相关研究，多集中在穿膜肽可增加微生物细胞对抗菌活性物质，如抗菌肽、肽核酸和功能化光动力抗菌纳米粒子的摄取，从而起到抑菌效果增强的作用。

此外，最近几年来，科研工作者们也开始将穿膜肽应用于质粒、纳米材料的微生物细胞载运。2018年，Munish Kumar首次实现了基于Tat的衍生穿膜肽与纳米金偶联物的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌转运。2019年，Md Monirul Islam等首次通过将含有荧光蛋白mCherry报告基因的205 kb质粒pMSR227与穿膜肽(KH)₉-BP100非共价偶连后直接与细胞孵育的方式，成功将质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞，并证实该方法的转化效率与电穿孔相似，并明显高于热休克法的转化效率。

综上叙述可见，穿膜肽已经开始应用于微生物细胞的外源物质活细胞载运，其具有运载多种外源物质进入微生物活细胞的应用潜力。但目前，尚未见穿膜肽介导外源蛋白进入链霉菌活细胞的相关研究及应用报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可介导外源蛋白高效导入链霉菌活细胞的方法，及该方法所涉及的穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法。利用穿膜肽向链霉菌活细胞导入目的蛋白可应用在链霉菌代谢产物检测、基因表达调控、细胞功能调控、生物防治等方面。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种细胞穿膜肽-目的蛋白复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）构建出CPP-mCherry蛋白表达质粒pET28a-CPP-mCherry：将穿膜肽、4个甘氨酸连接肽、荧光蛋白mCherry融合表达基因构建于大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)中；

（2）将质粒pET28a-CPP-mCherry用氯化钙化学转化法转化入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）感受态细胞中；

（3）将CPP-mCherry重组表达菌株接种于含卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，220 rpm活化8 h，将活化菌株以1:100的体积比接种于250 mL 2×YT培养基中，加入250μL卡那霉素（浓度50-55 mg/mL）后培养4.5-5.5 h，待OD₆₀₀值达到0.6~0.8，将菌液降温至16℃后添加IPTG，于16℃、220 rpm诱导表达16~20 h；