[发明专利]一种基于单细胞水平检测循环肿瘤细胞分泌物的微流控系统及其使用方法

权利要求书

1.一种基于单细胞水平检测循环肿瘤细胞分泌物的微流控芯片，其特征在于，所述芯片包括一级螺旋结构和二级微液滴形成结构。

2.根据权利要求1所述的一种基于单细胞水平检测循环肿瘤细胞分泌物的微流控芯片，其特征在于，所述的一级螺旋结构包含样品入口（1），周期性扩张的螺旋通道（2），两个血细胞出口（3）和一个将目标肿瘤细胞输出到二级结构的连接通道（4）。

3.根据权利要求1所述的一种基于单细胞水平检测循环肿瘤细胞分泌物的微流控芯片，其特征在于，所述的二级微液滴形成结构包含分泌物检测底物入口（5），蛇形混合通道（6），油相入口（7），十字形液滴生成结构（8）和微液滴出口（9）。

4.一种微流控芯片系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1至3任意一项所述的微流控芯片、微液滴孵育设备、光源设备、检测设备。

5.一种如权利要求4所述的微流控芯片系统在单细胞水平上检测循环肿瘤细胞分泌物中的应用。

6.根据权利要求5所述的微流控芯片系统的应用，其特征在于，所述应用采用的样品包括外周血。

7.根据权利要求5所述的微流控芯片系统的应用，其特征在于，所述循环肿瘤细胞分泌物包括MMPs。

8.一种如权利要求4所述微流控芯片系统的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、样品制备：将肿瘤患者血液与红细胞裂解液置于离心管内混合均匀，室温孵育，期间轻轻颠倒混匀数次，待裂解完全后离心弃上清，获取白细胞与CTCs；向离心管内加入DMEM培养基，混合均匀制备细胞悬液；

步骤2、血液中肿瘤细胞的富集：将步骤1中制得的细胞悬液通过固定流速从血液样品入口（1）注入芯片，细胞悬液中的肿瘤细胞和血细胞在螺旋通道（2）中会受到涡旋升力和迪恩阻力两种力的作用，使得尺寸大的肿瘤细胞将从螺旋结构中心出口（4）流出，而尺寸小的血细胞将聚集成细胞束并从两个侧面出口（3）流出；

步骤3、包裹单个CTCs的微液滴的形成：将分泌物的检测底物从入口（4）进入芯片，步骤2中所述的螺旋结构中心出口（4）流出的细胞与上述检测底物经蛇形混合通道（6）混合，混合流体在十字形液滴生成结构（8）处被从油相入口（7）进入芯片的油相剪切成微液滴；

步骤4、微液滴的孵育反应：收集步骤3中生成的微液滴，并在细胞培养箱进行培养，使所述微液滴中的细胞能够产生待检测的细胞分泌物，并且所述细胞分泌物可与微液滴中的检测底物发生反应；

步骤5、分泌物检测：将步骤4中的微液滴置于倒置荧光显微镜下即实现对CTCs单细胞水平分泌物的检测。

9.根据权利要求8所述的微流控系统的使用方法，其特征在于，所述步骤2中所述固定流速为100~300μL/min。

10.根据权利要求8所述的的微流控系统的使用方法，其特征在于，所述方法可以用于在单细胞水平上检测循环肿瘤细胞分泌物。