[发明专利]用于禽腺病毒4型检测的引物、探针、基因芯片、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于禽腺病毒4型检测的引物、探针、基因芯片、试剂盒及其应用。本发明依据FAdV‑4的相关基因的多样性和规律性，结合基因芯片的原理以及TMB可视化显色系统的优势，获得用于检测禽腺病毒4型的引物和探针，建立一种可视化显色的基因芯片，实现可视化检测禽腺病毒4型的目的。该基因芯片的检测具有良好的特异性与灵敏度，其检测灵敏度可达2.99×10²copies/μL，结果准确，稳定，快速，且结果只需肉眼即可判读，具有巨大推广价值与广阔的商业前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于禽腺病毒4型检测的引物、探针、基因芯片、试剂盒及其应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowls Adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科(Adenoviridae)，禽腺病毒属 (Aviadenovirus)，我国主要流行的FAdV有FAdV-4、FAdV-8及FAdV-11，其中FAdV-4就是心包积液—肝炎综合征(HHS)的特异性病原。由FAdV-4引起的HHS一年四季均可发生，但夏秋季更常发生，一般呈隐性经过。该病主要发生于3～5周龄的肉鸡，蛋鸡、麻鸡、樱桃谷肉鸭及鹅等家禽也可被FAdV-4感染。另外，鸽子、不同种类的隼及鹦鹉也可以成为 FAdV-4的宿主。垂直传播是HHS的主要传播方式，家禽接触被污染的机械、工具和粪便也会造成该病的大范围传播。FAdV-4在多种家禽体内普遍存在，既可以水平传播又可以垂直传播，大大提高了防控的难度。虽然市面上有较多的灭活疫苗和弱毒疫苗，但至今并没有一个商品化的疫苗可以完全预防FAdV-4的感染。因此，不能仅仅依靠接种疫苗去预防HHS，提高饲养管理水平及提高种鸡引进时的检测水平也尤为重要。

目前针对FAdV-4的诊断方法包括血清学及分子生物学方法。间接酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)、病毒中和试验和琼脂扩散试验均被广泛应用于禽腺病毒的血清学诊断，常用血清学检测方法虽然操作简单，成本低廉，但检测灵敏度较低，尤其在低病毒载量情况下检测结果容易出现假阴性；禽腺病毒分子生物学诊断技术有 PCR、qPCR、LAMP技术及基因微阵列等技术，其中PCR和qPCR常常被用于禽腺病毒的实验室检测。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)：以DNA或cDNA为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可在短时间内使目的DNA片段得到扩增从而得到大量的目的片段；普通PCR虽具较高灵敏度与特异性、且对样品纯度要求低、操作简单、成本较低的优点；但依赖于特异性引物设计，以及结果观察需要额外的凝胶电泳，由于操作步骤与时间的增加也带来了更多引入污染的概率。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)：常用的qPCR方法分为染料法 (SYBR Green I法)与探针法(Taqman探针法)，二者均为在PCR反应过程中加入荧光基团，利用荧光信号的增加来反映产物的扩增，在此过程中荧光定量PCR仪读取实时的荧光信号，监测出荧光信号达到预定阈值的循环数(Ct值)。Ct值与病毒核酸浓度呈负相关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。相较于普通PCR，荧光定量PCR具有更优异的灵敏度和特异性；而染料法相较于Taqman探针法具有价格低廉的优势，但探针法具有更高的敏感度，因此在实际的检测中按需选择不同的方案；荧光定量PCR相较普通PCR具有更优异的特异性和灵敏度，且无需凝胶电泳，以及更快的反应时间，大大提升了实验结果的稳定性与可靠性。但该方法也具有以下局限性：仪器价格较高，单次检测成本较普通PCR有所提高，且需操作人员需要具备相关经验。