[发明专利]一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法

权利要求书

1.一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：雄性秦岭大熊猫麻醉保定，并对生殖器官检查，然后采用直肠电刺激方法采精并收集；

步骤2：对步骤1收集的雄性秦岭大熊猫精液品质检查；

步骤3：将步骤2检查后的雄性秦岭大熊猫精液颗粒冷冻或细管冷冻储存或试管冻存；

步骤4：使用步骤3储存的雄性秦岭大熊猫精液，进行雌性秦岭大熊猫的人工授精。

2.根据权利要求1所述的一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，其特征在于：所述步骤1的具体操作为：

步骤1.1：发情期雄性秦岭大熊猫禁食12h，促使胃内食物排空；

步骤1.2：使用氯胺酮4mg/kg-8mg/kg，辅助以异氟烷0.3mg/kg-0.5mg/kg或隆朋0.3mg/kg-0.5mg/kg，于大熊猫颈部或臀部进行肌肉注射麻醉；

步骤1.3：对步骤1.2麻醉后的雄性秦岭大熊猫的生殖器官检查；

步骤1.4：使用洁净纱布清理雄性秦岭大熊猫包皮内污物，使用37℃0.1％新洁尔灭多次清洗包皮内外，最后使用37℃灭菌生理盐水冲洗至无消毒剂残留；

步骤1.5：连接电刺激采精器，根据雄性秦岭大熊猫的后肢收缩程度，由低至高缓慢增加电压，连续刺激雄性秦岭大熊猫直肠20-30次，每次2s，直至精液流出；

步骤1.6：如果第1次没有刺激出精液或精液量太少，则间隔5min后再重复1.5步骤1次；

步骤1.7：持38℃预温的集精杯，待精液流出后，迅速接取，直到精液不再流出。

3.根据权利要求2所述的一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，其特征在于：所述步骤2的雄性秦岭大熊猫精液品质检查包括：精液气味检查、精液密度检查、精液pH值检查、精液精子活力检查、精液精子活率检查、精液精子运动状态检查、精液精子顶体完整性检查、精液精子形态检查、精液精子质膜完整性检查。

4.根据权利要求3所述的一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，其特征在于：所述步骤2的精液精子顶体完整性检查为：吸取1μL精液+9μLPOPE染液，染色90s后涂片，待涂片干后用100×油镜观察并评级。

5.根据权利要求4所述的一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，其特征在于：所述步骤3的颗粒冷冻具体操作为：

步骤3.1.1：将步骤2检查合格的雄性秦岭大熊猫精液用冷冻稀释液稀释，其中精液和冷冻稀释液比为1:3；

步骤3.1.2：将步骤3.1.1稀释后的大熊猫精液在4℃冰箱中平衡4h；

步骤3.1.3：将冻精板放入装有液氮的金属槽中浸泡3次，将冻精板提升到距液氮面5cm处，用温度计测量冻精板的温度，当温度下降到-80℃时，用微量吸管快速地把平衡好的精液以40-80μL/粒滴在冻精板上；

步骤3.1.4：步骤3.1.3完成2min后，把冻精板快速侵入-196℃液氮中，用平衡好的镊子把冷冻精粒装入玻璃小瓶中，放进液氮罐长期保存。

6.根据权利要求4所述的一种秦岭大熊猫人工采精及授精方法，其特征在于：所述步骤3的细管冷冻具体操作为：

步骤3.2.1：将步骤2检查合格的雄性秦岭大熊猫精液用TEST或SFS作1:3稀释；

步骤3.2.2：将步骤3.1稀释后的大熊猫精液在4℃冰箱中平衡4h；

步骤3.2.3：步骤3.2.2平衡后的大熊猫精液吸入细塑料管中，每管0.25mL，一端塞有棉花，另一端在注入精液后封闭，用在酒精灯上烧热的钳子融化塑料封闭；

步骤3.2.4：将步骤3.2.3封闭后的细塑料管放置于平衡好的试管架上层，温度为-20℃，离液氮面7.5cm，时间为1min；然后将细塑料管移至试管架下层，此时离液氮面2.5cm，-80℃，时间为1min；最后将细塑料管放入液氮中2min，之后装入纸筒中，放进液氮罐长期保存。