[发明专利]一种自闭症特征菌的体外培养方法

说明书

本发明公开了一种自闭症特征菌的体外培养方法，属于生物技术领域。本发明公开的自闭症特征菌体外培养方法以自闭症患者粪便悬液接种优化的厌氧培养基质组合物，在不同仪器设备中进行厌氧培养，能够在36‑72小时获得高度还原自闭症患者肠道微生态丰度和多样性的培养产物。

申请人：北京富玛特生物科技有限公司

发明人：张家树

技术领域

本发明涉及肠道微生物群的体外培养方法，更具体地涉及自闭症特征菌的体外培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

研究发现自闭症患者常伴随不同程度的肠胃症状以及肠道菌群失调。肠道菌群在自闭症的发病过程中扮演重要角色，但作用机制尚未完全明确。因而研究自闭症患者的特征菌群的组成和功能，特别是菌群与候选药物的相互作用是十分重要的。目前自闭症临床研究主要是在患者或动物体内进行的，对资源和设备要求很高，不具备推广到总体水平的可能。因而如何在体外最大限度还原患者肠道菌群生长的多样性和生理生化特征一直制约着自闭症特征菌的研究。研究现有肠道菌研究像常规的乳酸菌制剂一样，采用分离健康人肠道中存在的单个菌株并将其以组合物的方法进行体外培养。但是，先前的一些研究表明，这种方法在时间、人力和成本方面效率低下，特别是由于可培养的微生物分离株非常有限，它面临着根本的技术限制。而且由于群体感应，导致肠道微生物群落的生理和生化特性.基因表达的变化，显示出少量菌株组合物或单个菌株所不具备的特征。为了解决这些挑战，本发明建立一种体外培养方法，支持肠道微生物样本中大部分物种的生长；能够较好的还原自闭症患者肠道特征菌结构组成及其产生的影响宿主生理学和病理学的多种化学物质。

发明内容

本发明提供一种自闭症特征菌的体外培养方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，制备用于自闭症肠道菌群的厌氧培养基质组合物MG，调节pH为7.2至7.4，并于115℃灭菌30分钟，降至室温备用或保存在4℃备用；所述MG培养基质组合物包含按重量百分比计的12-15％血清消化粉、10-12％酪蛋白的胰酶消化物、8-10％Elendt M4培养液、3-5％氯化钠、3-6％酵母提取物、2-4％大豆的木瓜蛋白酶消化物，以及2.5-3.3％选自水溶性淀粉、丙酮酸钠和葡萄糖中的至少一种成分，1.0-3.0％的选自牛肉提取物、牛脑提取物、牛肝提取物的至少一种成分，2.0-5.0％选自磷酸氢盐、磷酸二氢盐、柠檬酸盐的至少一种成分，0.3-1.0％选自硫乙醇酸钠、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸、硫化钠中至少一种成分，0.02％维生素K、0.001-0.003％刃天青。

步骤2，从自闭症患者的粪便中制备原始特征菌悬液：称取适量自闭症患者供体新鲜粪便，加入2-4倍重量灭菌除氧生理盐水中进行均质化处理；再逐级过滤和灭菌除氧生理盐水离心洗涤2-3次得到患者肠菌沉淀，将沉淀按照重量比1∶2重悬于灭菌除氧生理盐水，制备得到自闭症特征菌悬液样品；所述菌悬液样品的制备在厌氧培养箱中进行，控制氧浓度为0％-5％。

步骤3，确定特征菌通气条件和培养周期：将步骤2制备的自闭症特征菌悬液接种到步骤1所述的厌氧培养基质MG中，获得OD₆₀₀为0.10-0.30预培养液；所述预培养液分装于带盖的96孔细胞培养板、带有丁基橡胶塞的试管或SHIME肠道厌氧模拟器中；通入体积比为90％氮气和10％二氧化碳，控制氧浓度为0％-5％；厌氧培养36小时至72小时，即可获得自闭症特征菌体外培养产物。

所述培养基质组合物MG可以为15％血清消化粉、10％胰酪蛋白胨、8％Elendt M4培养液、3％氯化钠、5％酵母提取物、4％大豆胨、2.5％葡萄糖、1.0％水溶性淀粉、2.0％牛肉粉、1.0％牛肝粉、2.0％磷酸二氢钾和磷酸氢二钠缓冲液、0.3％L L-半胱氨酸、0.2％硫乙醇酸钠、0.02％维生素K1、0.001％刃天青，标记为MG1。