[发明专利]一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法

说明书

本发明公开了一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法，通过将卵母细胞与空透明带进行共孵育，然后对共孵育后的透明带进行酶消化，得到大量与透明带结合的精子，该精子进行ICSI注射，显著提高了小鼠的受精率、囊胚形成率和出生率。通过该方法的应用，一方面提高了透明带与精子的结合率，避免了透明带反应，阻止多精受精的现象，获得大量与透明带结合的精子。同时，通过消化酶消化透明带，将透明带内部结合的优质精子释放，用于ICSI注射，最终显著提高了小鼠出生率，以期改善人类辅助生殖患者的临床结局。

技术领域

本发明涉及辅助生殖技术领域，尤其涉及一种通过获取高发育潜能精子提高妊娠率的方法。

背景技术

卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术是一种利用显微操作将单个精子注射到卵胞浆内，卵母细胞受精后，经体外培养形成早期胚胎，再选择优质胚胎移植到母体子宫内着床发育的一种辅助生殖技术。ICSI技术的应用，大大降低了辅助生殖所需精子的浓度、活动力和形态学标准，为众多不孕不育的夫妇带来了生育可能。多国家多中心的调查数据显示，ICSI在辅助生育中的使用率已由原来的39.6％上升到58.9％。目前，有些国家ICSI的使用率甚至已经达到了70％-80％(Simopoulou M,et al.Improving ICSI:A reviewfrom thespermatozoon perspective.Syst Biol Reprod Med,2016,62:359-371)。

但是，正常生殖过程中，能与卵母细胞进行受精的精子必须具有各种生理学功能并且通过重重障碍，例如穿过卵细胞透明带，才能发育形成受精卵。然而ICSI技术绕过了正常受精的绝大部分步骤，例如精子与透明带结合的顶体反应，人为选择形态正常的精子注射进入了卵母细胞。目前，传统的精子质量评价方式主要关注精子的形态和活率，精液样本主要经过直接洗涤法、密度梯度离心法或上游法等处理，然后将适量精子加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，经显微镜下观察，从中选择形态正常(头部呈卵圆形，长4.0-5.5μm，宽1μm；顶体占整个头部的40％-70％；颈部、中段或尾部无异常)、活动力良好(前向运动)的精子注射到卵细胞胞浆中。但上游法和密度梯度离心法分别基于精子迁移和精子沉淀作用来筛选精子，无法满足精子其他特质的筛选，如精子DNA的完整性、精子膜的成熟度、精子凋亡和精子超微结构等，而精子这些特质的缺陷往往是导致不育的关键因素。因此，目前很多研究从提高辅助生殖的安全性和成功率出发，寻找更好的精子优选方法，把关注点放在精子成熟度和功能上，其中用透明带结合精子进行ICSI注射是目前优质精子的筛选热点方法。

人类卵母细胞被透明带(ZP)层包裹，在有生育能力男性的射精精液中，尽管平均每次射精包含1-2亿个可活动的精子，但只有大约14％的可活动的精子能够在体外结合到人类的ZP，而低生育力男性人群，可以与透明带结合的活动精子甚至更少，平均为4.3％。因此，在自然受精过程中，只有结构健全的精子才能完成整个过程，因为精子必须有一个完整的顶体来结合ZP并出发顶体胞外作用。近年来许多研究表明(Braga et al.)认为结合ZP的能力可能是鉴定精子发育潜能的较佳方法，采用卵母细胞透明带上粘附的精子进行ICSI注射可以提高所形成胚胎的发育潜能，移植后提高妊娠率。其具体做法为用失去受精潜能的不成熟卵子的ZP去筛选高质量的精子，然后，用注射针管吸取透明带表面的精子进行ICSI注射，这样尽可能模拟自然选择的过程，弥补常规ICSI技术绕过顶体反应、精卵结合等自然受精生理过程的短板，以期提高ICSI的成功率。